新疆部分地区牛副结核病流行病学调查及抗体ELISA检测方法研究.pdfVIP

摘要 牛副结核病是由副结核分支杆菌（Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis ,MAP ） 引起的慢性增生性肠炎，主要表现为肠道出现浆液性分泌物，伴随长期腹泻以及体况不 良，有时危及病畜生命，使畜牧业遭受经济损失。国外是强制通报的传染病，我国定为 二类动物疫病。新疆地区牛场时有该病发生，但存在临床与其他疾病易混淆，难于鉴别 诊断的问题。本项研究对新疆不同地区牛场血清进行抗体检测，对临床疑似病例进行分 子生物学诊断，探索建立该病的血清学 ELISA 检测方法，为该病的诊断和防控提供技 术支持。 目的：调查新疆不同地区牛场牛副结核病血清抗体阳性情况，利用分子生物学方法诊断 牛副结核病疑似病例，掌握临床该病流行和发病情况；筛选副结核分枝杆菌重要抗原蛋 白，建立该病抗体检测的间接ELISA 方法，为建立适合本地区的牛副结核病的诊断方 法提供参考意见。 方法：1.采集新疆石河子、沙湾、奎屯等 13 个地区的牛场血液样本 681 份进行抗体检测； 2.对临床 64 份疑似发病牛粪便样本进行 PCR 法检测；3.分析牛副结核分枝杆菌重要抗 原蛋白表位构建串联重组蛋白 MAP3290-1595 表达载体，转化大肠杆菌经 IPTG 诱导表 达；4.通过 Western Blot 和间接 ELISA 方法验证重组蛋白 MAP3290-1595 反应原性；5. 棋盘方阵滴定法筛选基于重组蛋白建立的间接 ELISA 方法最优条件。 结果：1.新疆不同地区牛副结核病血清抗体平均阳性率为 6.17% （42/681 ），不同地区存 在差异；2.对临床疑似病例 PCR 检测阳性率 81.25% （52/64 ），阳性基因片段经测序确定 均为 Mycobacterium avium subsp. Paratuberculosis ,且 7 个序列同源性 100%；3.成功诱导 表达和纯化串联重组蛋白MAP3290-1595 ，浓度为 0.430 mg/mL，纯度大于90% ；4.Western Blot 和间接 ELISA 方法证实重组蛋白 MAP3290-1595 与牛副结核阳性血清具有较好反 应原性。5.初步筛选出重组蛋白建立的间接 ELISA 方法最优条件。 结论：1.新疆不同地区牛场均存在牛副结核病感染情况，临床腹泻病牛中感染牛副结核 分枝杆菌比例较高；2.成功表达牛副结核分枝杆菌串联重组蛋白 MAP3290-1595 ，初步 建立了 MAP 抗体间接 ELISA 检测方法。为该病在新疆地区诊断和防控提供基础数据。 关键词：牛副结核病、间接ELISA 、重组蛋白 Abstract Bovine paratuberculosis is a chronic hyperplastic enteritis that caused by Mycobacterium tuberculosis subsp. Paratuberculosis (MAP). The main manifestation of the disease is the presence of serous secretions in the intestine, accompanied by long-term diarrhea and poor physical condition. It endangered the lives of the infected cattle occasionally, which causing huge economic losses to the breeding industry. The disease is defined as a compulsory notification of infectious diseases abroad and designated as a Class II animal epidemic. The disease, which o