高效液相色谱详解郝建涛.pptxVIP

高效液相色谱（HPLC）;目 录;一、基础理论; 溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。 ; 色谱分析法的分类;2、分离模式——键合相色谱、液液色谱、尺寸排阻色谱; 色谱图和峰参数 色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线。 基线(base line)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。 噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。 漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。;色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。 峰高(peak height，h)-峰的最高点至峰底的距离。 峰宽（peak width，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。 半峰宽（peak width at half-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。 峰面积(peak area，A)-峰与峰底所包围的面积。 死时间(dead time，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。 保留时间(retention time，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。;流动相的洗脱方式;等度洗脱;梯度洗脱;;;梯度洗脱是 HPLC 的常用手段;4、高效液相色谱法的应用范围;5、HPLC的系统;;Agilent 1100 高效液相色谱仪;;　　　　　;分离系统－色谱柱;吸附剂－－－化学键和固定相色谱柱 化学键合相色谱柱:70% 将不同的官能团通过化学反应键和到硅胶表面的游离羟基上，而形成化学键和固定相，进而形成化学键和相色谱柱。 反相: C18, 65%; C8, 15%; 反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。 正相: 20%; -NH2、 -CN 其它 (手性柱， 离子交换柱): 10%;柱温箱;;检测系统;药典中的液相检测器; 检测器简介（一）;2019/11/8;荧光检测器（fluorescence detector） （FLD） 原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。 特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。　　;检测器简介（四）;检测器简介（五）;二、上机操作前，我们需要准备好什么？ 如：样品怎么处理？ 流动相怎么选？ 仪器参数怎么设置？ ;1．样品的前处理;;样品过滤头的类型： 30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格材料有，纤维素，醋酸纤维，聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。 13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。 3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。;滤膜类型： 聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。 醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。 尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。 再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。;注意：1：每张滤膜只能用一次。 2：水相和有机相不要搞混。 ;;2．流动相的配制;流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。 在流动相配制好后，一定要进行脱气。;准备流动相;1) 色谱级纯或优级纯乙腈或甲醇 水－－超纯水，18.2MΩ·cm;;为什么要过滤？;;目 的;常用的脱气方法;3、流动相流速的选择;4、波长选择;5．记录时间;三、Agilent 1100 机器操作;1、检查流动相 ;Purge阀 ;1、检查流动相 ;2、冲洗管路;3、打开电脑，等待TAP窗口出现;4、打开1100各模块开关;指示灯状态;