课件：蛋白质的构件氨基酸.ppt

层析法的基本原理 层析法是利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。 （一）基于分配系数差异的分离方法—分配层析法 分配系数 Kd= CA CB CA：一种物质在A相（流动相）中的浓度 CB：一种物质在B相（固定相）中的浓度 原理：主要根据被分析的样品（如aa混合物）在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的。 固定相和流动相 混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在两相中的分配情况。 1、柱层析 层析柱中的填充剂或支持剂表面附着一层结合水作为固定相，沿固定相流过的与它互不相溶的溶剂是流动相。当用洗脱剂洗脱时，柱上端的氨基酸混合物在两相之间会按不同的分配系数以不同的速度向下移动。分步收集层析柱下端的洗脱液，然后分别用茚三酮显色定量，以氨基酸量对洗脱液体积作图得洗脱曲线，曲线中的每个峰相当于某一种氨基酸。 加洗脱剂 氨基酸样品 支持剂 层析柱 分部收集 1.0 0.5 0.1 光吸收值 20 40 60 80 100 120 流出液（毫升） 2、纸层析 固定相：滤纸纤维素上吸附的水 流动相：展层用的溶剂 层析时，混合氨基酸在这两相中不断分配，使它们分布在滤纸的不同位置上。 基本步骤：点样、展层、显色、定性（定量） 层析时，将样品点在滤纸的一个角上，称为原点。然后将其放入一个密闭的容器中，用一种溶剂系统进行展层，当溶剂展层至距滤纸上沿1～２cm时（约要40分钟），取出滤纸，作好前沿位置标记后，烘干滤纸（1分钟） 。向滤纸上喷茚三酮显色液至显色，就会在滤纸上出现各种氨基酸的斑点。 丁醇-醋酸 氨基酸的滤纸层析图谱 由于各种氨基酸具有不同的迁移率（ Rf ），因此它们就会彼此分开。 将各显色斑点的Rf值与标准氨基酸的Rf值比较，可得知该斑点的成分 。 溶剂前沿 氨基酸显色点 滤纸 原点 X Y 滤纸层析中的Rf值，Rf =X/Y 斑点到原点（点样处）的距离 Rf = -------------------------------------------- 溶剂前沿到原点之间的距离 3、薄层层析（thin-layer chromatography)： 基本步骤： 铺板、点样、展层、显色、定性（定量） 把支持物涂布在玻璃板上使其成为一个均匀的薄层，把要分析的样品滴加在薄层的一端，然后用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层，使样品中各个成分分开，最后进行鉴定和定量分析。 （二） 离子交换层析 离子交换层析：是以离子交换剂为固定相，以特定的 含离子的溶液为流动相，利用离子交换剂对需要分离 的各种离子结合力的差异，而将混合物中不同离子进行分离的层析技术。 离子交换树脂： 化学本质：是一种人工合成的聚苯乙烯一苯二乙烯组成的具有网状结构的、不溶于水的高分子聚合物，分子中含有可解离的基团。 外观： 阳离子交换树脂：树脂上带有酸性基团，本身带负电荷。如磺酸基-SO3H或-SO3Na （强酸型），羧基-COOH（弱酸型）。可解离出H+或Na+。 阳离子交换剂和它所吸引的电荷 若选择阳离子交换树脂，则带正电荷的物质与H+发生交换而结合在树脂上。 阴离子交换树脂：本身带正电荷，含有碱性可解离基团，如季胺基- N+(CH3)3OH- 。可解离出OH-。 阴离子交换剂和它所吸引的电荷 若选择阴离子交换树脂，则带负电荷的物质可与OH-发生交换而结合在树脂上。 分离氨基酸混合物常使用强酸型阳离子交换树脂； 氨基酸与树脂的亲和力决定于：①氨基酸与树脂上解离基团之间的静电引力（主要）②氨基酸侧链与树脂基质聚苯乙烯之间的疏水作用； 弱作用力先被洗脱下来。 图2-17 氨基酸分析仪记录的氨基酸洗脱曲线 THANK YOU SUCCESS * * 可编辑 * * * * * * * * * 3.杂环氨基酸（2种，杂环带组脯） Pro的α-亚氨基是环的一部分，因此具有特殊的刚性结构，一般出现在两段α-螺旋之间的转角处，Pro残基所在的位置必然发生骨架方向的变化； His带有咪唑基，是在生理pH条件下唯一具有缓冲能力的氨基酸。His在酶的酸碱催化机制中起重要作用。 按R基的极性性质： 1.非极性R