第4章 荧分析法.pptVIP

荧光分析法 药物分析教研室 第1节 基本原理 第2节 分析方法 第3节 荧光分光光度计 第4节 应用示例 要求 掌握荧光分析法的基本原理 熟悉荧光分光光度计的基本构造 了解荧光分析法的定量方法 概 述 定义 优点 与UV比较 相关定义 荧光 荧光分析法 分子紫外-可见荧光分析法 荧光 物质分子吸收光子能量而被激发，然后从激发态的最低振动能级返回到基态时所发射出的光。 荧光分析法 根据物质的荧光谱线位置(波长)及强度进行物质鉴定和物质含量测定的方法 。 分子紫外-可见荧光分析法 有些物质的分子，在用紫外-可见光激发时，能发射荧光，由此建立的方法。 优 点 灵敏度高：检出限可达10-10~10-12g/ml 选择性好 FL与UV比较(一) 相同点 λ区段：Vis-UV区 适用性：均可用于定性定量， 多用于定量 定量方法：相似 样品性质: 以液体为主 用 量：均少 分析时间：均快 操作难易程度：易 FL与UV比较(二) 不同点 第1节 基本原理 分子荧光的产生 激发光谱与荧光光谱 荧光与分子结构关系 分子荧光的产生 (一)分子的电子能级与激发过程 (二)荧光的产生 (一)分子的电子能级 荧光和磷光产生示意图 (二)荧光的产生 振动弛豫 内部能量交换 荧光的发射 外部能量交换 体系间交叉跃迁 磷光的发射 电子 激发态 → 基态 方式 辐射和无辐射 荧光 辐射跃迁 磷光 振动弛豫 内部能量交换 无辐射跃迁 (热能形式) 外部能量交换 体系间交叉跃迁 激发光谱与 发射光谱(一) 定 义 硫酸奎宁的激发光谱a 及荧光光谱b 激发光谱与发射光谱(二) 特征 斯托克斯位移 荧光光谱形状与λex无关 荧光光谱与激发光谱互为镜像。 1）斯托克斯位移 (1852年) 溶液荧光光谱中，所观察到的荧光波长总是大于激发光波长，这种波长移动的现象称为斯托克斯位移（Stokes shift）。 斯托克斯位移说明了在激发与发射之间存在着一定能量损失 斯托克斯位移原因 1：激发态分子通过内转换和振动弛豫过程迅速到达第一激发单线态S1*的最低振动能振动能级。(主要) 2：荧光发射可能使激发态分子返回到基态的各个不同振动能级，然后进一步损失能量。 3：激发态分子与溶剂分子相互作用。 2）荧光光谱形状与λex无关 内转换和振动弛豫，使激发到S1*的各个振动能级的电子，下降至S1*的最低振动能级→荧光发射光谱只有一个发射带。 由于荧光发射通常发生于第一电子激发态的最低振动能级，与激发至哪一个电子激发态无关，所以荧光光谱的形态通常与激发波长无关。 3）荧光光谱与激发光谱互为镜像 电子基态的振动能级分布与激发态相似，所以ΔE相同。 小峰间Δλ与ΔE有关，强度与跃迁几率有关，跃迁几率相似。 蒽的激发光谱及荧光光谱 蒽的能级跃迁 三、荧光与分子结构关系 一.荧光效率或荧光产率 二.荧光强度与分子结构的关系 三.影响荧光强度的外界因素 一.荧光效率 荧光寿命 荧光效率 荧光寿命： 当除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的1/e所需的时间称为荧光寿命（fluorescence life time）。 常用τf表示。 荧光效率： 激发态分子发射荧光的光子数与基态分子吸收激发光的光子数之比，常用φf表示： φf (0~1) φf 大的有荧光发射 例如:荧光素钠在水中φf =0.92；荧光素在水中φf =0.65；蒽在乙醇中φf =0.30；菲在乙醇中φf =0.10。 荧光效率低的物质虽有较强的紫外吸收，但所吸收的能量都以无辐射跃迁形式释放，内转换与外转换的速度很快，所以没有荧光发射。 二.荧光强度与 分子结构的关系 产生荧光的两个条件　 影响φf因素（内部因素） 　 产生荧光的两个条件 强紫外-可见吸收 一定的荧光效率 　 影响φf因素（内部因素） 跃迁类型 共轭效应（长共轭结构） 刚性结构与共平面性效应 取代基效应 　 跃迁类型 分子结构中存在共轭的π→π*跃迁，也就是K带强吸收时，才可能有荧光发生 　 共轭效应（长共轭结构） π电子共轭程度越大，荧光强度（荧光效率）越大，而荧光波长也长移。eg: