第三章 凝胶电泳PPT.ppt

第三章 凝胶电泳;电泳方法的分类——根据支持物; 一类是如纸、醋酸纤维素薄膜、硅胶、矾土、纤维素等。这些介质相对来说是化学惰性的，能将对流减到最小，使用这些支持介质进行蛋白质分离和在自由溶液中一样是基于pH环境中的蛋白质的电荷密度。;分子筛效应：分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。分子量小，阻力小，移动快；分子量大，阻力大，移动慢。 电荷效应：电荷量不同，迁移率不同。;醋酸纤维薄膜电泳以醋酸纤维薄膜为支持介质。醋酸纤维素是纤维素的醋酸酯，由纤维素的羟基经乙酰化而成。它溶于丙酮等有机溶剂，可涂布成均一细密的微孔薄膜，即醋酸纤维素膜（cellulose acetate membrane，简称CAM）。 ;（1）预处理 膜的准备：根据分离样品的多少将醋酸纤维薄膜裁切成合适的大小，在膜片无光泽的一面上用铅笔轻轻划一条加样线。加样线可选在距膜片一端2～3cm处，有时也可选在膜片的中央线附近。 膜片浸透：在一浅碟或培养皿中倒入所选择的缓冲液，将膜片小心地浮铺在缓冲液面上，将膜片的的无光泽面朝下。膜片的底面吸收电极缓冲液后逐渐下沉，直至电极缓冲液将膜片完全浸透。 膜片在电极缓冲液完全浸透后，用钝头镊子取出，稍稍用滤纸吸去多余的缓冲液，然后将膜片夹在两层滤纸之间吸干多余的缓冲液，但不能吸得过干而出现不透明的白色部分。; 用铅笔在薄膜无光泽面一端2cm处画一细线，加样时平稳地前后或左右来回移动加样器，于细线处加样。 毛细管、微量吸管、微量注射器或印模都可以用来加样。 线型加样 醋酸纤维膜上的样品线条宽度不应超过4 mm，样品线与膜片上边边缘之间的距离一般为3~5 mm。 样品的加样量或加样体积随样品的浓度、染色和检测方法等条件的不同而有较大的变化。; （3）电泳 电泳前，先用钝头镊子将加过样的膜片安放在电泳槽的支架上，膜片两端约0.5~1.0 cm的部分应与支架的顶面紧贴，膜面尽可能不与手指直接接触，以免膜面受到污染。如果在同一电泳槽内同时安放几张膜片，应避免相邻膜片之间彼此接触。 在电泳槽的两个电极室内注入适量的电极缓冲液，用3 ~ 4层滤纸作盐桥。膜片的两端分别用滤纸盐桥盖住，以此将膜片拉平固定并使电流通过。盖上电泳槽盖，让膜片在电泳槽内水平静置平衡10分钟，然后将电泳槽的两个电极与直流电源的正负极分别相接。;染色剂要求：不应溶解醋酸纤维薄膜 一般蛋白质的染色方法 氨基黑10B染色：酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。 丽春红S方法：是一种水溶性的阴离子重氮染料，带负电荷的丽春红分子与正电荷的蛋白质氨基基团结合，也可以非共价键形式与蛋白质非极性区域结合，显示红色蛋白条带。用3%三氯醋酸配制0.2%丽春红S溶液，将干燥的膜片浸入此染色剂中。染色时间不需要严格控制，但一般染色10分钟比较合适。;（5）漂洗/脱色 将薄膜取出后，移至漂洗液中，漂洗若干次，至无蛋白区无色。 （6）干燥和透明 干燥：避免膜片发生卷曲。常用的方法是将膜片夹在两张滤纸之间，通过滤纸来吸除膜片上多余的液体，然后取出膜片重新夹在两张滤纸之间，并用合适的平面重物平压，直至膜片完全干燥平整为止。 为了长期保存和进行光吸收扫描测定，需要对膜片进行透明化处理。方法是将干燥的膜片浸入透明液中10~20分钟，然后取出平贴于玻璃板上或夹在两块大小合适的玻璃板之间，干后即为透明的薄膜图谱，可以进行扫描测定。 ;（6）定量测定; 醋酸纤维薄膜电泳应用范围较广，可用于检测和分析血清蛋白、脂蛋白、糖蛋白、体液、脊髓液、脱氢酶、多肽、核酸以及其他生物大分子物质。由于醋酸纤维薄膜电泳法快速且简便，目前在医学和临床生物化学等领域已成为一种常规技术。;蛋白质名称;;优点： 精确性高。 快速省时。一般电泳45-60min即可。 　　 灵敏度高，样品用量少。 　　 应用面广。如胎儿甲种球蛋白，溶菌酶，胰岛素，组蛋白等用醋 酸纤维薄膜电泳能较好地分离。 有利于扫描定量及长期保存。 　　 缺点： 分离效果不太好。;;电泳不仅能分离含有各种大分子物质的混合物，而且可以研究生物大分子的特性。诸如如电荷、分子量、等电点以至于构象。 在恒定的、非解离的缓冲系统中来分离蛋白质，属于非解离电泳。在电泳过程中仍然保持蛋白质的天然构象、亚基之间的相互作用及其生物活性，因而根据其电泳迁移率，可得到天然蛋白质的分子量。 ; 聚丙烯酰胺凝胶 (PAGE)——聚合反应;单体-丙烯酰胺结构式 ;催化剂：过硫酸胺或核黄素; ;1、试剂质量 2、温度和氧气的影响 3、凝胶浓度及丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的比例。 凝胶的机械性能、弹性是否适中是很重要的，胶太软易于断裂