第二章 环境生物技术的生物学基础PPT.pptVIP

第二节 基因工程 1. 定义：将外源基因体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。 2. 理论和技术支撑 （1）理论：40年代发现了生物的遗传物质是DNA、50年代弄清了DNA的双螺旋结构、60年代确定了遗传信息的传递方式。 （2）技术：工具酶、DNA序列分析、载体 3. 基因工程实施至少四个必要条件：工具酶、基因、载体、受体细胞 4. 基因工程操作的基本技术 5. 基因工程在环境污染治理中的应用 第二章 环境生物技术生物学基础第一节 酶工程 酶工程：是利用酶的催化作用进行物质转化的技术，是将酶学理论与化工技术结合而形成的新技术。 其主要任务是：通过预先设计，经过人工操作控制而获得大量所需的酶，并通过各种方法使酶发挥出最大的催化功能；目的是为我们提供产品或以特定的功能为我们服务。 　　　　1、生产、分离纯化 　　　　2、酶分子修饰 3、酶的固定化 　　　　4、酶的应用 一、酶的生产及分离纯化 （一）酶的生产 1. 对酶源的要求 酶含量丰富 提取、纯化方便 2. 微生物作为酶的优势 　易得到所需的酶类 　易获得高产菌株 　生产成本低 　微生物生长周期短 　生产易管理 　提高微生物产酶能力的途径较多 　可提高酶产量或改造酶 3.对酶生产菌的要求 　1）不是致病菌，也不产毒素 　2）不易变异退化，不易感染噬菌体 　3）产酶量高，而且最好产生胞外酶 　4）原料廉价，周期短，易培养 （二）酶的分离纯化 酶的分离提纯可分为四个要点： 　　酶源选材 　　匀浆方法 　　分离步骤 　　结晶方法 酶的分离提纯涉及的理论与技术： 　　酶主要是蛋白质 　　酶具有催化功能 酶分离提纯步骤如下： 半匀浆 选材 提取液 粗酶 制品 精制 细胞器 纯酶 酶结晶 抽取或分散 亲　和 分离法 少量酶 分离方法 结晶法 2．酶分离纯化的沉淀技术 1）盐析———溶解度的差异 　盐溶－低浓度的中性盐可增加电解质类物质的溶解度； 　盐析－当盐浓度继续增加时，蛋白质的溶解度反而降低而析出。 （1）基本原理 　 a.减弱了蛋白质的水合程度 b.中和了蛋白质电荷，使静电荷减少　 （2）影响因素 　 a.蛋白质的浓度 b.介质的pH c.温度 d.盐类型 2）PEG沉淀法———溶解度的差异 （1）基本原理 　　空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。 （2）影响因素 a. 蛋白质的分子质量——大，沉降好 b. 蛋白质浓度 c. pH值 d. 离子强度 e. 温度 f. PEG聚合度 3)有机溶剂沉淀法——溶解度的差异 （1）基本原理 　 a.介质的介电常数下降，增强静电作用力 b.降低水合程度 （2）常用方式 　　a.分级沉淀有用的蛋白质 b.杂蛋白质变性 （3）缺点——易使酶变性，低温操作 4）等电点沉淀法——溶解度的差异 　　蛋白质在等电点（ｐI）处，净电荷为0，易于沉淀。 5）热变性沉淀法——热稳定性的差异 　　可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变性温度提高。 3.酶分离纯化的层析技术 　层析分离——是利用混合物中各组分的物理化学性质｛分子的大小和形状、分子极性、吸附力、分子亲和力和分配系数｝的不同，使各组分的分布程度不同而达到分离。 1）凝胶过滤层析——分子大小和形状的差异 基本原理 　　酶液中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，从而实现分离纯化。 优点 　　条件温和，操作简便，分离范围广，回收率高，层析柱可反复使用，无需再生处理,可分段分离。 常用的凝胶 　　交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 2）离子交换层析——电荷性质的差异 　　它利用离子交换剂上可解离基团对各种离子的亲和力不同而进行分离。 　（1）基本原理 　　蛋白质是两性电解质，不同蛋白质由于其pI不同，在同一种pH值介质中电离状况不同，分子所带电荷种类和数量就不同，与离子交换剂的静电吸附能力也不同。通过吸附和改变离子强度或pH值解吸洗脱，可使蛋白质依据其静电吸附能力由弱到强的顺序而分离开来。 （2）洗脱方法 　a.梯度洗脱　b.阶段洗脱 3）亲和层析——亲和力的差异 （1）基本原理 　利用配基与酶结合能力而将目的酶分离出来。 （2）载体 a.应具有均一、坚实、多孔的网状结构 b.亲水 c.具有可活化和改变的化学基团 d.具有良好的化学稳定性 交联琼脂糖凝胶 (3)配基 　a.配基与酶的亲和力 　b.配基与载体的结合方式 　　引入手臂可避免配基在载体上密度太大而造成的空间障碍。　　W-氨烷基化合物 4）高效液相色谱 （1）基本原