芽孢杆菌ahe1抗真菌肽的分离纯化 性质及产生条件研究-study on isolation, purification and production conditions of antifungal peptides from bacillus ahe 1.docxVIP

摘要真菌引起的病害日益严重，芽孢杆菌可产生多种抗真菌物质而受到人们的重视。芽孢杆菌AH-E-1为一株新发现的菌株，前期研究表明它能有效抑制白色念珠菌。为进一步研究它的抗真菌活性和寻找新的抗真菌物质，本文对芽孢杆菌AH-E-1及其发酵上清液进行研究，并对其产生的抗真菌肽的分离纯化和性质进行研究，最后对产生抗真菌肽的发酵条件进行初步优化。研究内容如下：采用对峙法、覆盖法、插片法等对芽孢杆菌AH-E-1及其发酵上清液的抗菌活性进行研究，发现该菌株能显著抑制13种植物致病真菌及11种人类致病真菌；该菌株能引起真菌菌丝扭曲等变形；其产生的抗真菌物质存在于发酵上清液中，该发酵上清液能抑制丝状真菌孢子萌发及芽管和菌丝生长，与1mol/mL的两性霉素B相比该发酵上清液对白色念珠菌抑制作用更强。通过硫酸铵沉淀、有机溶剂萃取、等电点沉淀、有机溶剂沉淀和甲醇浸取对抗真菌物质进行粗提，经比较其效果选用甲醇浸取对抗真菌物质进行粗提。通过水合茚三酮等实验对抗真菌物质进行了初步定性。通过对抗真菌肽的三种分离纯化路线进行比较，选用超滤、反相色谱及HILIC色谱对抗真菌肽进行分离纯化，获得了色谱级的抗真菌肽。研究表明：抗真菌物质为肽类物质，其分子量约为500~1000Da，极性很强，不可电离，具有热稳定性、抗紫外线性和耐酸碱性，能耐氯仿等5种有机溶剂，并且对胰蛋白酶(1mg/mL)等6种酶稳定。通过单因素和正交实验对芽孢杆菌AH-E-1产生抗真菌肽的发酵条件进行初步优化，研究表明抗真菌肽的产生受多种因素影响，其中碳氮比增加有利于该抗真菌肽的产生，培养基、发酵时间、装液量、接种量和培养基初始pH这5个因素对该芽孢杆菌产生抗真菌肽的影响大小依次为：培养基发酵时间装液量=接种量培养基初始pH。较佳摇瓶发酵条件为：在500mL三角锥瓶中加入150mL初始pH值为7.0的PDB（200）培养基，接入10%的芽孢杆菌AH-E-1液体菌种，在37℃下培养24h。关键词：芽孢杆菌抗真菌肽分离纯化性质发酵条件ABSTRACTThediseasescausedbyfungiareincreasinglyserious.BecauseBacillussp.canproduceavarietyofantifungalagents,ithasattractedtheattentionofpeople.Bacillussp.AH-E-1wasanewlydiscoveredbacteriastrainwhichcouldstronglyinhibitCandidaalbicansinpreviousstudies.TofurtherstudyantifungalactivitiesofBacillussp.AH-E-1andscreennovelantifungalsubstances,westudiedBacillussp.AH-E-1andthefermentationsupernatantfromit.Subsequently,theisolation,purification,andcharacterizationoftheantifungalpeptidesproducedbyBacillussp.AH-E-1werestudied.Finally,wepreliminarilyoptimizedthefermentationconditionsofproducingtheantifungalpeptides.Thestudieswereasfollows:TostudytheantibioticactivitiesofBacillussp.AH-E-1anditsfermentationsupernatant,confrontationmethod,overlayassay,thecoverslipinsertionmethodandsoonwereused.Thestudiesshowedthatthestraincouldstronglyinhibitagainst13strainsofphytopathogenicfungiand11strainsofhumanpathogenicfungi,andthatthestraincouldinducemycelialdistortionoffilamentousfungiandsoon.TheantifungalsubstancesproducedbyBacillussp.AH-E-1wereinitsfermentationsupernatantwhichcouldinhibitsporegerminationandgivesuppressiontogermtubeandmycelialgrowth.Theinhibito