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重组人胶原蛋白肽表达及纯化工艺优化 　　摘要：将重组大肠杆菌ｐＣ６－ＢＬ２１活化后，用ＩＰＴＧ诱导表达，探讨了大肠杆菌中重组胶原蛋白肽的最佳表达及纯化条件。结果表明，菌株在３７ ℃，接种量为２％，摇瓶培养３．０ ｈ后，加入终浓度为０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ的ＩＰＴＧ，３０ ℃诱导５．０ ｈ，收获的蛋白产量最高，经Ｎｉ－ＮＴＡ柱亲和层析纯化，用梯度咪唑缓冲液洗脱蛋白，１５０ ｍｍｏｌ／Ｌ咪唑缓冲液洗脱蛋白为纯蛋白，Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ分析显示该表达产物与人ＣＯＬ６Ａ２单克隆抗体有特异结合能力。 　　关键词：重组人胶原蛋白肽；纯化；表达 　　中图分类号：Ｑ８１６文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）13－2768-04 　　 　　Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｌａｇｅｎ Ｐｅｐｔｉｄｅ 　　 　　ＷＵ Ｍｉｎｇ，ＸＵ Ｚｈｅｎ－ｚｈｅｎ，ＷＡＮＧ Gａｎｇ，ＳＵＮ Ｙａｎｇ，ＣＨＥＮ Ｇｕａｎｇ 　　（Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｊｉｌｉｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３０１１８， Jilin，Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ recombinant hｕｍａｎ cｏｌｌａｇｅｎ pｅｐｔｉｄｅ（ＣＰ６） ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ｐＣ６－ＢＬ２１， ｔｈｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ， ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｙ ａｎｄ ｔｉｍｅ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｓ ｗｅｌｌ ａｓ ｉｎｄｕｃｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｆｏｒ ＣＰ６ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ． ｃｏｌｉ ｗａｓ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ． Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ， ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｎｇ ａｔ ???ｎ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ２％， ｔｈｅ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗere ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｆｏｒ ３.0 ｈ ａｔ ３７ ℃； ｔｈｅｎ ０．５ ｍｍｏｌ／Ｌ ＩＰＴＧ ｗａｓ ａｄｄｅｄ ａｓ ｉｎｄｕｃｅｒ； ａｎｄ ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｕｎｄｅｒ ３０ ℃ ｆｏｒ ５．０ ｈ． Ａｆｔｅｒ ｆｅｒｍｅｎｔｅｄ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ， ｔｈｅ ｌｙｓａｔｅ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｎｉｃｋｅｌ ｉｏｎ ａｆｆｉｎｉｔｙ； ａｎｄ ｐｕｒｉｔｙ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ． Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｐｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｉｆ ｅｌｕｔｅｄ ｂｙ １５０ ｍｍｏｌ／Ｌ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ ｂｕｆｆｅｒ ａｆｔｅｒ ｂｅｉｎｇ ｐｕｒｉｆｉｅｄ， aｎｄ ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｕｌｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｉｎｄ ｗｉｔｈ ｈｕｍａｎ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＯＬ６Ａ２． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： rｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ hｕｍａｎ cｏｌｌａｇｅｎ pｅｐｔｉｄｅ； ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ 　　 　　胶原蛋白是一类广泛分布于动物结缔组织的蛋白质［１］，对维护机体的正常生理功能和损伤修复有重要作用。目前胶原蛋白的生产主要是用酸、碱水解法从动物结缔组织提取，提取过程中会或多或少地丧失胶原蛋白的生物活性，应用于人体时还可能会产生排异反应，且存在着极大的病毒隐患［２，３］。鉴于胶原蛋白有广阔的应用前景，特别是医用材料、保健品领域迫切需要大量优质的胶原蛋白，寻找新的安全可靠的手段制备胶原蛋白十分重要，利用基因工程手段重组表达人胶原蛋白成为研究热点［４－６］。本实验以ＬＢ培养基为基础，采用单因素实验对重组人胶原蛋白在大肠杆菌中诱导表达的一系列条件，如接种量、诱导时机、诱导物浓度、诱导温度和表达时间等进行了优化［７］，并对所得的胶原蛋白进行了纯化和鉴定，为进一步研究发酵工艺提供了实验基础。 　　１材料与方法 　　１．１材料和试剂 　　实验菌种为重组大肠杆菌ｐＣ６－ＢＬ２１（ＤＥ３），由吉林农业大学生物物理实验室构建并保存。质粒提取试