第二章基因操作的主要技术知识原理 基因工程课件.pptVIP

第二章基因操作的主要技术原理 ;核酸的凝胶电泳 扩增原理 分子杂交 测序;核酸的凝胶电泳 它是一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，同时也是分子生物学研究方法的技术基础。 ;基本原理 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极移向正极。根据核酸分子大小不同、构型或形状的差异，以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中的不同成分彼此分开。 ;电泳的迁移率取决于核酸分子本身的大小和构型。分子量较小的DNA分子，比分子量较大的DNA分子迁移率要快；同等分子量的不同构型的核酸分子，构型紧密的比松散型的开环DNA分子或线性DNA分子迁移率要快 ;LMP琼脂糖 熔点：62～65℃ 熔解后，在37℃ 可保持液态数小时； 在25℃ 可保持液态约10min ;回收DNA分子 在65℃ 下将LMP琼脂糖凝胶熔化； 加入过量的酚抽提DNA； 离心获得含DNA分子的上清液； 直接酶切 ;琼脂糖凝胶电泳的参数： 缓冲液：1× TAE（TBE TPE） 凝胶的含量：根据检测的DNA大小 加DNA样品：1μg，指示剂 电泳条件：大片断低电压长时间，小片段高电压短时间 染色和观察：溴化乙锭（ethidium bromide，EB）染色，在300nm波长的紫外下观察（凝胶成像仪）。 能看到0.05 μg的微量DNA DNA的片断大小与荧光强度成正比 ;Separation Range Vs. % Agarose; 用已知分子量的标准DNA对DNA片断大小的估算 ;Sample Well 25 ng 1 kb ladder 0.8% Agarose;;Agarose gel electrophoresis;Agarose gel electrophoresis;聚丙烯酰胺凝胶电泳 缓冲液：TBE 凝胶聚丙烯酰胺：丙稀酰胺/ 亚甲双丙稀酰胺（29：1）；TEMED和过硫酸铵（ 10％ ）。 ;PolyAcrylamide Gels;脉冲电场凝胶电泳（PFGE） 1984年，D.R.Cantor发明的。分离超大分子量的DNA分子。 在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。 ;在脉冲电泳中，电场方向是周期变化的，头一个脉冲电场方向与核酸的移动方向成45 ℃角，下一个脉冲的电场方向与核酸移动方向在另一侧成45 ℃角，由于加在琼脂糖凝胶电泳上的电场方向、电流大小、以及作用时间都在交替地变换着，这就使得DNA分子必须随时调整其泳动的方向，来适应凝胶孔隙的无规则变化。 与分子量小的DNA分子相比，分子量大的DNA分子需要较多的次数来更换其构型和方位，使之能够按新的方向游动，所以迁移率就慢，从而达到了分离大分子量DNA分子的目的。 107bp的DNA大分子。 ;PFGE can resolve large DNA fragments;基因扩增（gene amplification） 主要内容： 1.体外扩增 2.通过体外重组和转化，将目的基因在宿主细胞进行扩增 3.在环境作用下，生物体内相关基因的扩增。 4.程序基因扩增 5.进化过程中的基因扩增;PCR技术 在1983年，美国Cetus公司人类遗传研究室的科学家K.B.Mullis发明的。 PCR是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，有称之为体外扩增法。;;温度（℃）;Reaction Condition for a Typical PCR Assay;Typical PCR Thermal Profile;Some DNA Polymerases Used in PCR;Characteristics of Taq Polymerase ;PCR引物： 与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡核苷酸片断。 1.其长度通常在15~30个核苷酸之间。 2.简并引物 at