id1基因对bmp2维持兔髓核细胞软骨特性的影响-effects of id1 gene on bmp - 2 maintenance of rabbit nucleus pulposus cell cartilage characteristics.docx

重庆 重庆医科大学硕士研究生学位论文 万方数据 万方数据 英汉缩略语名词对照 英文缩写 ACAN 英文全称 Aggrecan 中文全称 蛋白多糖 Ad Adenovirus 腺病毒 BMPs Bone morphogenetic proteins 骨形态发生蛋白 bp Base pair 碱基对 ℃ Centigrade 摄氏度 cDNA Complementary deoxyribonucleic acid 反向转录脱氧核糖核酸 col Collagen 胶原蛋白 DEPC Diethyl phosphorocyanidate 焦碳酸二乙酯 DNA Deoxynucleic acid 脱氧核糖核酸 dNTP Deoxy-ribonucleoside triphosphate 三磷酸脱氧核糖核苷 ELISA Enzyme-linked immunosorbent assayassa 酶联免疫吸附实验 FBS Fetal bovine serum 胎牛血清 GFP Green fluorescence protein 绿色荧光蛋白 h Hour 小时 Id Inhibitor of differentiation 分化抑制因子 IDD Intervertebral disc degeneration 椎间盘退变 min Minute 分钟 NP NucleusPulposus 髓核 MOI Multiplicity of infection 感染复数 OD Optical density 光密度 PBS Phosphate buffer saline 磷酸盐缓冲液 PCR Polymerase chain reaction 聚合酶链反应 RNA Ribonucleic acid 核糖核酸 RNAi RNA interference 核糖核酸干扰 RNase Ribonuclease RNA 酶 1 rpm Revolutions per minute 每分钟转数 sec Second 秒 TE Tris-HCl and EDTA buffer Tris 一盐酸乙二氨四乙酸缓冲液 TGF Transforming growth factor 转化生长因子 TMEMED μl Tetramethylethylenediamine Microlitre 四甲基乙二胺 微升 2 Id1 基因对 BMP-2 维持兔髓核细胞软骨特性的影响 摘 要 目的：构建过表达和沉默 Id1 基因的慢病毒载体，以兔椎间盘髓核细 胞为研究对象，观察经 BMP-2 诱导后的髓核细胞内 Id1 基因的表达水平调 整以后细胞分泌软骨特性因子的变化，研究 Id1 在 BMPs 维持椎间盘细胞 软骨表型中的作用。 方法：（1）设计针对 Id1 基因过表达和 RNA 干扰(RNAi)的序列，应用 基因重组技术将目的基因片段连接到慢病毒载体，然后感染 293T 细胞之 后进行测序鉴定与病毒滴度检测；（2）以两种慢病毒分别感染兔髓核细 胞，QRT-PCR 和 Western blot 检测髓核细胞 Id1 mRNA 和蛋白质的表达； （3）重组腺病毒 AdBMP2 感染髓核细胞后，利用已制备的两种慢病毒再次 感染细胞，QRT-PCR、ELISA 检测细胞表达软骨特性分子的能力与变化趋势。 结果：（1）成功构建 Id1 基因过表达与 RNAi 慢病毒载体，测序结果 与 Id1 基因序列比对后确认一致。（2）慢病毒感染髓核细胞后，Id1 基因 的 mRNA 与蛋白的表达量与正常细胞组及空载病毒感染组比，过表达组增 加，RNAi 组下降，符合预期结果。（3）细胞内 Id1 的表达增加可促进软骨 特性因子 colⅡ（0.407±0.083）和 ACAN（0.284±0.074）的 mRNA 表达。 （4）AdBMP2 处理细胞后，Id1 基因表达增加可使 colⅡ（0.590±0.072） 和 ACAN（0.351±0.066）的 mRNA 表达进一步显著升高；Id1 表达降低时， 以上因子的表达被明显抑制(colⅡ:0.244±0.060, ACAN:0.168±0.034)。 3 结论：Id1 能够促进兔椎间盘髓核细胞软骨特性分子的表达，细胞内 Id1 基因水平变化能够显著影响 BMP-2 诱导细胞分泌软骨特性因子。Id1 是 BMP-2 维持兔髓核细胞软骨特性作用的关键因子。 关键词：慢病毒，分化抑制因子 1，骨形态发生蛋白 2，髓核细胞 4 EFFECT OF ID1 GENE ON BMP-2 MAINTAINING THE CARTILAGE PHENOTYPE OF RABBIT INTERVERTEBRAL DISC CELLS ABSTRACT Objectiv