hplcmsms检测血中bpdedg加合物方法的建立及人群生物监测-establishment of hplc msms method for detecting bpd edg adduct in blood and its population biological monitoring.docx

原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，系本人在导师的指导下，独立研究所取得的成果。除文中特别加以标注的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本论文的研究作出任何贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表示谢意。本声明的法律责任由本人承担。学位论文作者：日期：年月日学位论文使用授权声明本人在导师指导下完成的论文及相关的职务作品，知识产权归属郑州大学。根据郑州大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版。本人允许论文被查阅和借阅，郑州大学可以将本学位论文的全部或部分编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或者扫描等其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。同时，本人保证，离校后发表、使用学位论文或与该学位论文直接相关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为郑州大学。学位论文作者：日期：年月日摘要BPDE-DNA加合物是多环芳烃(PAHs)在体内活化代谢的产物，在化学致癌过程中处于核心地位。若体内形成的BPDE-DNA加合物不能被机体及时修复，将引起基因突变，导致遗传的不稳定，最终诱发癌症。因此，BPDE-DNA加合物作为一种重要的暴露生物标志物，对研究环境和职业PAHs暴露的致癌机制以及健康风险评价都具有十分重要的意义。常用的DNA加合物检测方法包括：32P-后标记法、免疫分析法、色谱-质谱联用法。其中，HPLC-MS/MS方法具有高通量、高灵敏度、高特异性的特点，可以同时定性定量检测微量的BPDE-DNA加合物，适用于评价环境和职业暴露PAHs的健康风险。因此，建立和优化高特异性、高灵敏度、高通量的HPLC-MS/MS检测BPDE-DNA加合物的方法，能够为开展PAHs环境和职业暴露的生物监测以及健康风险评估提供方法学支持。本文采用水饱和正丁醇的萃取方法，通过优化HPLC-MS/MS建立了检测脐带血中BPDE-DNA加合物的方法。该方法利用[15N5]BPDE-dG作为内标，采用化学合成的BPDE-dG作为外标，定性和定量分析脐带血中BPDE-dG加合物。该方法灵敏度高、特异性强，适用于大量人群样本的生物监测和分子流行病学研究。本实验的研究内容主要包括以下4个方面：1、标准品的合成、纯化和定量：分别合成BPDE-dG加合物和[15N5]BPDE-dG加合物作为外标和内标。采用HPLC纯化合成的标准品，用紫外分光光度计对纯化后的标准品进行定量。2、脐带血前处理方法和HPLC-MS/MS条件的建立和优化：采用脱氧核糖核酸酶、磷酸二酯酶和碱性磷酸酶酶解DNA，结合液液萃取方法，富集脐带血中BPDE-dG加合物。采用多反应监测(SRM)方法，建立检测脐带血中BPDE-DNA加合物的方法。该方法与现有方法比较，DNA用量少，通常需要10μgDNA，最低可以检测5μgDNA，灵敏度较高，该方法检测限为：每109个dG中可检测出2.7个BPDE-dG加合物。该方法具有简便易行、回收率高的特点，回收率为97%~112%。I3、该方法用于孕妇脐带血中BPDE-dG加合物的检测：42个出生缺陷新生儿母亲脐带血和42个随机选择的正常新生儿母亲脐带血来自淮河流域重点地区出生缺陷研究队列。研究结果显示：（1）LC-MS/MS检测方法应用于检测脐带血中BPDE-dG加合物，该方法检测精度、重现性均满足检测要求，与现有方法比较，该方法仅需要较少量生物样品，一般需要10μgDNA，最低可以检测5μgDNA，适用于大量人群的生物监测和分子流行病学研究。（2）将出生缺陷新生儿和正常新生儿母亲脐带血进行分层，按照孕妇居住乡镇在污染高聚集区（一般距离河较近）和污染低聚集区（一般距离河较远）进行分层。脐带血中∑PAHs和BaP暴露水平病例组高于对照组，差异有统计学意义（P0.05）。6种∑PAHs和BaP暴露水平和及BPDE-dG加合物含量均高于对照组，在污染高聚集区∑PAHs和BaP暴露水平病例组和对照组比较有统计学差异（P0.05）。（3）脐带血中BPDE-dG加合物水平病例组高于对照组，污染高聚集区高于污染低聚集区，但没有显著差异（P0.05）。关键词：HPLC-MS/MS；BPDE-dG；脐带血；生物监测IIAbstractBPDE-DNAadductistheimportantmetaboliteofPAHs,whichplaysakeyroleintheprocessofchemicalcarcinogenesis.IfBPDE-DNAadductscan’tberepaired,itwillinduceinstabilityofgenomeanddirvetocancer.Asanimportantbiomarker,BPDE-DNAadductplayanimportantrol