hplcmsms分析干血滤纸片维生素a及其前体的方法学研究-methodological study on analysis of vitamin a and its precursors in dry blood filter paper by hplc msms.docx

重庆医科大学博士研究生学位论文 重庆医科大学博士研究生学位论文 万方数据 万方数据 符号说明 英文缩写 英文全称 中文全称 VA Vitamin A 维生素A VAD Vitamin A deficiency 维生素A缺乏 R Retinol 视黄醇 RA retinyl acetate 视黄醇乙酸酯 RP retinyl palmitate 视黄醇棕榈酰酯 β-c β-carotene β-胡萝卜素 DP declustering potential 解簇电压 EP entrance potential 入口电压 CE collision energy 碰撞能量 CEP collision cell entrance potential 碰撞室入口电压 CXP collision cell exit potential 碰撞室出口电压 psi per square inch 平方英寸 atmospheric chemical APCI  ionization 大气压化学离子化 ESI electrospray ionization 电喷雾离子化 MRM multiple reaction model 多反应监测模式 BHT Butylated hydroxytoluene 3,5-二叔丁基-4-羟基甲苯 LOD limits of detection 最低检测限 LLOQ lower limits of quantitation 最低定量限 1 HPLC-MS/MS 分析干血滤纸片维生素 A 及其前体的方法学研究 摘 要 目的 将高灵敏度的串联质谱检测技术与高效能、高分离能力的高效液 相色谱技术相结合，建立干血滤纸片中视黄醇及其乙酸酯、棕榈酰酯、 β-胡萝卜素的定量分析方法，为微量血检测诊断新生儿维生素A缺乏症 奠定方法学基础。 方法 本文详细考察了干血滤纸片中视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕 榈酰酯和 β-胡萝卜素质谱、色谱分离分析和提取的最佳条件。在质谱 分析中研究分子离子峰、碎片离子峰、解簇电压、碰撞能量、碰撞室 入口电压和出口电压等，以获得分析的最佳质谱条件；在色谱分析中， 通过对固定相、流动相、柱温的研究，以优化色谱分离条件；比较几 种常用的不同前处理方法，通过计算不同前处理方法所获得的各物质 峰面积，确定最适萃取方法。 在最佳质谱、色谱和萃取条件下, 采用内标法建立HPLC-MS/MS 定量分析干血滤纸片中视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯和β- 胡萝卜素的方法，考察基质效应、线性范围、检出限、准确度、精密 1 本课题由国家自然科学基金资助（批准号 2 度，以及本方法分析干血滤纸片视黄醇结果与HPLC方法检测血清视黄 醇的相关性。 结果 视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯和β-胡萝卜素质谱检测条 件得到优化；选择了C8柱作为固定相，含5%二氯甲烷的甲醇作为流动 相，流速0.2 ml/min，等度分离，柱温20℃等为最适宜色谱条件；100μl 去离子水，200μl甲醇及300μl三氯甲烷对干血滤纸片中视黄醇及其前体 的萃取效果最好。 本方法测定视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰酯和β-胡萝卜素 的基质效应分别为98.0%，96.7%，90.0%和82.1%。在标准曲线中的浓 度范围内分析的线性相关系数均大于0.99，最低检测限分别为 16.2ng/ml，5.3ng/ml, 6.3 ng/ml,53.75ng/ml，最低定量限分别为65ng/ml， 21.3ng/ml, 25.0ng/ml,53.75ng/ml。加标回收率为85.5%，84.5%，83.5% 和73.5%。批内变异系数4.30%-7.35%，批间变异系数4.85%-9.40%。50 例6月-70月儿童干血滤纸片浓度的分别为0.48±0.16μg/ml， 0.115±0.06μg/ml， 0.02±0.01μg/ml， 0.19±0.11μg/ml。本方法分析50 例儿童干血滤纸片视黄醇结果与其HPLC方法检测血清视黄醇结果相 关系数0.81，表明具有相关性。 结论 用优化的质谱、色谱条件和提取方法，首次成功建立了HPLC -MS/MS定量分析干血滤纸片中视黄醇、视黄醇乙酸酯、视黄醇棕榈酰 酯和β-胡萝卜素的方法，该方法能够满足微量血标本（9.6μl全血）视 3 黄醇及其前体定量分析的需要。为分析微量血维生素A提供一种简便、 易行、高通量、多组分同步分析的方法，为新生儿维生素A缺乏症的诊 断奠定了方法学基础。 关键词：高效液相色谱-串联质谱，维生素A，干血滤纸片，方法 学 4 DEVELOPMENT ,VALIDATION AND APPLICATION OF AN HPLC-MS/MS METHOD FOR T