hplcelsd测定茶树可溶性糖含量及gs基因的克隆与表达-hplcelsd determination of soluble sugar content in tea and cloning and expression of gs gene.docx

目录摘要ⅠABSTRACTⅡ1引言11.1茶树抗寒生理的研究现状11.1.1茶树叶片形态与抗寒性11.1.2细胞膜系统与抗寒性11.1.3保护酶与抗寒性11.1.4光合作用和呼吸作用与抗寒性11.1.5渗透调节物质与抗寒性21.1.6植物激素与抗寒性31.2茶树抗寒分子机制的研究现状低31.2.1保护基因31.2.2调节基因31.2.3其他相关基因31.3可溶性糖在植物代谢调节中作用的研究现状41.3.1植物糖代谢的相关反应及酶类41.3.2植物根系糖代谢的相关生理研究41.3.3植物棉子糖系列寡糖的代谢41.3.4肌醇半乳糖苷合成酶与抗寒性的研究现状51.4研究目的与意义61.5研究内容与技术路线61.5.1研究内容与方法61.5.2技术路线72材料与方法82.1试验材料82.2仪器与试剂82.2.1主要实验仪器82.2.2主要试剂82.2.3引物合成与测序92.3试验方法92.3.1越冬期间茶树可溶性糖含量的变化测定92.3.2肌醇半乳糖苷合成酶(GS)基因全长克隆102.3.3越冬期间茶树GS基因的实时荧光定量PCR分析193结果与分析213.1自然越冬期间茶树体内可溶性糖含量的动态变化213.1.1标准曲线的制作213.1.2合肥地区越冬期间气温变化223.1.3茶树中果糖含量的动态变化233.1.4茶树中葡萄糖含量的动态变化243.1.5茶树中蔗糖含量的动态变化253.1.6茶树中棉子糖含量的动态变化274讨论364.1关于越冬期茶树体内可溶性糖成分检测结果的讨论364.2关于越冬期间茶树根系中可溶性糖含量变化结果的讨论364.3关于越冬期间茶树体内棉子糖检测结果的讨论374.4GS的全长克隆和序列分析结果的讨论374.5越冬期间GS基因的qRT-pcr表达分析结果的讨论374.6茶树中肌醇半乳糖苷合成酶基因上游调控序列分析385结论39参考文献40附录A中英文缩写与注释43致谢44个人简介45图表清单图1-1植物中棉子糖系列寡糖代谢图1-2技术路线图3-1四种可溶性糖的标准曲线图3-2四个标准样品的HPLC图谱图3-3叶片样品的HPLC图谱图3-4嫩根样品的HPLC图谱图3-5越冬期间最高温度和最低温度变化情况图图3-6越冬期间茶树体内果糖含量的变化图3-7越冬期间茶树体内葡萄糖含量的变化图3-8越冬期间茶树体内蔗糖含量的变化图3-9越冬期间茶树体内棉子糖含量的变化图3-10茶树总RNA图3-11GS基因3’-RACE扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图图3-12GS基因5’-RACE扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图图3-13GS基因全长cDNA的扩增产物凝胶电泳检测图3-14CsGS核酸序列和编码的氨基酸序列图3-15CsGS跨膜区的预测分析结果图3-16茶树中GS与其它植物中GS氨基酸序列比较图3-17CsGS系统进化树图3-18实时荧光定量PCR标准曲线图3-19越冬期间茶树GS基因表达水平的qRT-PCR分析表2-1本实验中用到的引物表3-1基因上游调控序列中的顺式作用元件1引言1.1茶树抗寒生理的研究现状1.1.1茶树叶片形态与抗寒性茶树是一种原产于热带的喜温暖植物，随着茶叶产业的发展其种植区域向北扩增，长期对低温胁迫的适应过程中，通过自然选择茶树逐渐发展和形成了对抗低温胁迫的抗寒性[1,2]。不同茶树品种间耐低温能力存在显著差异。研究表明，叶片小、叶色深、叶肉厚、保护组织发达的灌木型茶树抗寒性较强，在-10℃的低温下才会出现冻害。而乔木或半乔木型的大叶种在温度低于0℃时就会受寒害[3]。位于叶片表面的角质层构成叶片的保护层，其厚度与抗寒性呈一定的相关关系，且上表皮层的作用更显著[4]。1.1.2细胞膜系统与抗寒性细胞膜的流动性和稳定性是细胞及植物的生命活动基础。董合铸等[5]研究表明，低温使叶绿体被膜破坏，片层膜分散于细胞质中，类囊体、内质网、高尔基体空泡化，细胞膜的结构遭严重破坏。Steponkus[6]研究发现，质膜大面积收缩和膨胀容易引起细胞膜破裂，丧失渗透应答能力和细胞内形成冰晶也是细胞膜也是细胞膜损伤的表现。Lyon等（1973）提出的“膜脂相变”冷害机制假说表明，植物的膜相变温度取决于膜脂脂肪酸的不饱和度，脂肪酸的不饱和度与膜的冷稳定性呈正相关。寒冷环境中膜脂的过氧化也会破坏膜系统的稳定性。丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的主要产物之一，MDA的积累是活性氧毒害作用表现,其含量的增加与膜透性呈正相关[7]。聂庆娟等[8]对四种常绿阔叶植物的研究表明，抗寒性较强的黄杨在降温处理下表现为MDA含量先降低后增加的趋势，在-20℃—0℃间MDA含量均有下降，而其他树种在同样处理下MDA总体含量表现为增加的变化趋势。1.1.3保护酶与抗寒性植物因低温引起的代谢失调会使细胞体内产生过多的氧自由基，而保护酶可以清除氧自由基从