ho1调控nrf2are信号通路对脑出血后神经保护作用的实验研究-experimental study on the neuroprotective effect of ho1 on nrf 2 are signaling pathway after intracerebral hemorrhage.docx

本研究得到以下项目支持：①国家自然科学基金项目（№Nrf2-ARE信号通路调控脑出血灶周小胶质细胞的机制研究）②江西省青年科学家培养对象项目(No:赣科发计字[2011]186号文件莱菔硫烷激活Nrf2/ARE通路对脑出血灶周损伤影响的实验研究)③江西省卫生厅重大攻关计划项目(No:赣科发计字[2011]30号文件：编号20//4033RNA干扰诱导Nrf2基因沉默在脑出血灶周水肿影响的实验研究）II摘要目的与背景：脑出血后继发的脑组织损伤是影响预后、转归的关键因素，而炎性因子及自由基的瀑布式产生对脑出血后继发性脑损伤起决定性作用。研究发现血红素加氧酶-1（HO-1）广泛在中枢神经细胞（神经元及胶质细胞）中表达，是Nrf2-ARE信号通路下游一重要抗氧化及解毒蛋白，对脑出血后继发性脑损伤具有抗炎性反应、减轻氧化应激损伤、抑制细胞凋亡等神经保护作用。本研究运用HO-1的选择性抑制剂锌原卟啉-9（ZPP-IX）抑制HO-1表达，观察用药后Nrf2-ARE通路上下游蛋白Nrf2、NF-κB等表达的变化并结合神经功能评分的差异来探讨HO-1对脑出血灶周神经保护作用的机制，为脑出血的治疗提供新的实验理论依据。方法：采用SD雄性大鼠基底节自体股动脉血注射法建立脑出血模型，分四组：正常组、ICH组、ZPP-IX+ICH组、DMSO+ICH组。通过免疫荧光、Westernblot、RT-PCR观察术后各组不同时间点血肿周围binding-Nrf2（Nrf2-Keap1）、Nrf2、HO-1、NF-κBp65、TNF-α蛋白及相应mRNA表达变化并结合神经功能评分，对所得数据进行统计学分析（单因素方差分析，t检验）。结果：ICH组较正常对照组Nrf2、HO-1、NF-κB、TNF-α的表达在术后6h即开始升高，48-72h达峰，至第7天表达量仍高于正常组，而binding-Nrf2的表达在脑出血后12h开始减少，48h减少最明显。ZPP-IX组与ICH组比较，神经功能障碍加重，出血灶周binding-Nrf2、NF-κBp65、TNF-α表达增加，Nrf2、HO-1表达减少，差异在48-72h最明显，且差异持续到第7天。DMSO组较ICH组神经功能评分及各蛋白表达无明显差异。结论：⑴HO-1在脑出血后早期表现出神经保护作用；⑵脑出血后6h开始Nrf2-ARE信号通路激活，表现为Nrf2及下游HO-1的表达增多，而这一变化与ICH后脑水肿的高峰时间一致，推测Nrf2-ARE信号通路通过对抗脑水肿而对出III血灶周继发性脑损伤具有神经保护作用，且很可能是通过HO-1这一关键蛋白；⑶HO-1可抑制脑出血后的炎性反应,表现为促进上游蛋白Nrf2的解离及入核，即激活Nrf2，并抑制NF-κBp65及下游炎性因子的表达。关键词：脑出血；血红素加氧酶1；Nrf2-ARE信号通路；神经保护作用。IVABSTRACTObjectiveandbackground:Thesecondarydamageofintracerebralhemorrhageinperihematomatissueisthekeyfactorfortheoutcome,thewaterfallofinflammatoryfactors,freeradicalarecrucialfactorstothesecondarybraininjureafterintracerebralhemorrhage.Studiesshowthathemeoxygenase1(HO-1)iswidelyexpressedinthecentralnervecells(neuronsandglialcells),whichisanimportantdownstreamanti-oxidantanddetoxicationproteinofNrf2-AREsignalingpathway,andhasneuroprotectionofanti-inflammatory,anti-oxidantandanti-apoptosis.Thisstudyusezincrotoporphyrin–IX,whichisaselectiveinhibitorofHO-1,toinhibittheexpressionofHO-1,toobservetheexpressionofNrf2-AREpathwayupstreamanddownstreamproteinsuchasNrf2,NF-κB，combinedwithneurologicalscore.ToexplorethemechanismofHO-1neuroprotectiononperi-hematomaafterZPP-IXtreatment,forp