hiv1患者体内膜蛋白序列变异与广谱中和抗体产生关系的研究-study on the relationship between variation of membrane protein sequence and production of broad-spectrum neutralizing antibody in hiv - 1 patients.docx

3.HIV-1患者血浆样本的中和特性分析483.1中和单抗对来源于HIV-1患者的假病毒分析483.2HIV-1患者不同时间点血浆对不同时间点假病毒中和情况504.与广谱中和抗体产生相关的特异性区域或位点的分析534.1与广谱中和抗体产生相关的特异性区域的分析534.2与广谱中和抗体产生相关的特异性位点的分析55四、讨论59五、小结63参考文献64综述72人类免疫缺陷病毒膜蛋白特点与广谱中和抗体产生关系的研究进展72发表文章82致谢83版权声明84学位论文使用授权说明853英文缩略词HIVAIDSHumanImmunodeficiencyVirusAcquiredImmunodeficieneySydrome人类免疫缺陷病毒获得性免疫缺陷综合征EnvEnvlope包膜蛋白质gpGlycoprotein糖蛋白BrNAbbroadneutralizingantibody广谱中和抗体MAbmonoclonalantibody单克隆抗体MSMmanwhohassexwithman男男同性恋PNLGpotentialN-linkedglycosylationsiteN-连接糖基化位点CD4bsCD4bindingsiteCD4结合位点CRFsthecirculatingrecombinantforms流行重组型MPERmembraneproximalexternalregion外侧近膜区ID50LB50%inhibitingdilutionLuria-Bertanimedium半数抑制浓度LB培养基SGASingle-genomeamplification单基因组扩增ODOpticalDensity光密度PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链反应SGASingle-genomeamplification单基因组扩增TCID50MRCA50%TissueCultureInfectiveDosethemostrecentcommonancestor半数组织培养感染剂量最近共同祖先4摘要自1981年HIV-1被首次发现，并于1984年确定为获得性免疫缺陷综合症的病原体以来，艾滋病已成为严重威胁人类健康的公共卫生问题。真正控制乃至消除艾滋病的理想途径是有效疫苗的研发和应用。目前大多数成功疫苗都是通过诱导有效的中和抗体来保护机体免受感染的，例如乙肝（HBV）疫苗、人乳头瘤病毒（HPV）疫苗、流感疫苗等[1]。HIV的膜蛋白(Env)位于病毒颗粒表面，是中和抗体的唯一作用靶位。然而，由于HIV膜蛋白基因的易变性和低免疫原性，迄今为止还没有疫苗能在体内诱导有效中和抗体。在HIV自然感染过程中，15%～25%的患者可以产生广谱中和抗体，虽然这类抗体不能清除患者体内的病毒，但能在体外中和目前已分离的大部分病毒株。对于HIV患者体内该类抗体产生过程和机制的研究，将会对HIV疫苗设计，特别是基于中和抗体的疫苗设计有很好的指导意义。本课题首先用假病毒中和试验对HIV患者血浆样本进行检测，检测样本为来自我国北京的HIV-1阳性的MSM人群，共75份，包括我国流行的三个主要亚型：B’、BC和AE亚型，感染时间一年半以上，血浆检测所用假病毒为：SC19-15（BC亚型）、S91-2（AE亚型）、SF162（B亚型）和M1-27（B’亚型），并以VSV假病毒作为对照，排除血浆的非特异反应。基于中和至少两种类型的假病毒，AE亚型血浆的中和活性最高，达53%（20/38）；BC亚型和B’亚型血浆分别占27%（3/11）和23%（6/26）。从中，我们选择了9份中和效力和中和广谱性较好的HIVAE亚型患者样本：YA141（B）、YA155（C）、YA165（D）、YA086（E）、YA087（F）、YA099（G）、YA093（H）、YA218（I）和YA223（J），同时选择了1份未产生中和抗体的样本YA132（A）。对上述10位患者从最初感染至感染一年半之后的系列血浆样本进行中和抗体检测，所选假病毒为较难中和的CRF01_AE亚型假病毒，包括：GX24.8、GX71.18、BJ5.11和SHX346.6。发现4位患者D、E、F和I能够中和多株病毒，产生了亚型内的交叉保护中和抗体，其中E患者中和广谱性和中和抗体滴度最好。因此，我们将YA086（E）和YA132（A）分别作为产生和未产生广谱中和抗体的两类患者进行后续分析。我们构建了YA086（E）和YA132（A）两位患者不同时间点的膜蛋白准种库，5分别为E2、E5、E7、E9、E10和A2、A6、A8、A11，每两个时间点的时间间隔约为30周。对其序列分析，发现E患者相对于A患者有更高的序列多样化（p0.05）及离散程度。接下来，用已知单克隆抗体对两位患者的系列假病毒进行中和，得出两位患者的病毒株对