ho1基因转染脂肪间充质干细胞在支气管哮喘中的作用及机制研究-study on the role and mechanism of ho1 gene transfected adipose-derived mesenchymal stem cells in bronchial asthma.docx

HO-1 HO-1 基因转染脂肪间充质干细胞在支气管哮喘中的作用及机制研究 中文摘要 中文摘要HO-1 中文摘要 HO-1 基因转染脂肪间充质干细胞在支气管哮喘中的作用及机制研究 HO-1 基因转染脂肪间充质干细胞在支气管哮喘中的 作用及机制研究 中文摘要 第一部分：脂肪间充质干细胞的分离、培养及鉴定 目的：分离、培养小鼠脂肪间充质干细胞（Adipose-derived mesenchymal stem cells ，ADSCs），通过流式细胞技术和干细胞多能分化诱导技术对干细胞进行鉴定， 掌握体外干细胞培养技术，了解干细胞的生物学特性。 材料与方法：用无菌技术切取 6-8w 的 BALB/c 小鼠腹股沟及腹部脂肪组织，用 I 型胶原酶消化获得 ADSCs，将细胞培养在含 10%胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS） 的 L- Dulbeeo 改良的 eagle 培养液（Dulbeco’s modified eagle medium ，DMEM）培养 基中，采用单纯贴壁法对鼠 ADSCs 进行分离，并在体外进行 ADSCs 传代培养、纯化。 用倒置显微镜每天观察细胞生长，计算细胞贴壁率，绘制 ADSCs 的生长曲线，用流 式细胞仪对 ADSCs 表面标志物 CD90、CD44、CD11b、CD45 进行鉴定，然后用不同 的诱导液诱导 ADSCs 向成脂肪、成骨、成软骨细胞分化，并采用油红 O 染色、改良 Gomori 钙钴法、Von Kossa 染色、阿尔新蓝染色等方法进行鉴定。 结果：接种后第 2d，细胞开始稀疏地贴附于培养瓶的表面，呈纺锤形，少数呈 三角形、多角形。在第 3d 换液时，发现大多数细胞均已贴壁。至第 5d 左右，细胞呈 集落样生长，形态呈成纤维细胞样梭形细胞。至第 9-10d，细胞集落生长至 80%融合， 细胞呈均一的梭形，成旋涡状排列，2w 左右，细胞可长满瓶底。传代细胞以均匀分 布的方式生长，5-7d 就几乎完全融合，1w 左右即可以传代一次。细胞接种后 2h 左右， 即有部分细胞出现贴壁，贴壁率为 29.4%±1.3%，24h 的贴壁率 97.3%±1.8%。接种后 第 1d 即有细胞生长，但前 3d 细胞生长比较缓慢，第 4-8d 细胞生长显著加快，至第 8d，细胞生长接近融合。传至 3 代后，细胞的形态呈现均一的长梭形、成纤维状。经 测定 CD90、CD44 阳性细胞达到 96.6%和 85.3%；CD11b、CD45 阳性细胞均为 0.5%， 在不同的诱导环境下，可分化为成脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。表明所得细胞 I PAGE PAGE VI III III 为 ADSCs。 结论：通过 I 型胶原酶和单纯贴壁法可以体外获得大量 ADSCs，具有较强的增 殖能力，细胞表面标志 CD90、CD44 阳性，CD11b、CD45 阴性，体外具有很强的多 向分化潜能。 第二部分：携带 HO-1 基因慢病毒的包装和 ADSCs 的转染 目的：制备携带血红素氧化酶-1（Heme oxygenase-1，HO-1）基因的慢病毒载体， 并对其进行测序鉴定，在 293T 细胞中进行慢病毒包装，得到高滴度的携带 HO-1 基 因的慢病毒，进行 ADSCs 的转染。 材料与方法：从新鲜脾脏组织中抽提出小鼠总 RNA，将总 RNA 反转录合成 cDNA 。根据小鼠 HO-1 基因（GeneBank 序号：NM_010442.2），设计并合成 HO-1 基 因引物，利用人工合成的引物，采用 RT-PCR 技术钓取目的基因 HO-1 的 cDNA 片段， 再将目的基因片段与 pMD18T 载体连接，再将酶切线性化的 pMD18T-HO-1 与酶切线 性化的 pCDH-MCS-EF1-GFP-Puro 载体连接，其产物转化感受态细菌 XL10-gold。对 长出的克隆先进行菌落鉴定，挑取符合预期的阳性克隆进行测序。然后在 293T 细胞 内，进行慢病毒的包装，收集、浓缩病毒颗粒并检测病毒滴度，最后将携带 HO-1 基 因的慢病毒转染 ADSCs，并运用 RT-qPCR 和 Western-Blot 的方法检测 ADSCs 的 HO-1mRNA 和 HO-1 蛋白的表达情况。 结果：琼脂糖电泳及测序证实成功构建了重组 pCDH-CMV-HO-1 载体，HO-1 基 因被成功导入 pCDH-CMV-MCS-EF1-GFP-Puro 载体，在 293T 细胞内，成功地包装成 携有 HO-1 基因的慢病毒，病毒滴度为 3×108 TU/ml。成功地将携有 HO-1 基因的慢 病毒转染至 ADSCs，运用 RT-qPCR 和 Western-Blot 的方法能在 ADSCs 检测到高水 平 HO-1