hlb感染柑桔韧皮部内生细菌区系的分析-analysis of endophytic bacteria flora in citrus phloem infected by hlb.docx

摘要柑橘是世界上产量最大的水果，巴西是世界上产柑橘最多的国家，其次是中国、美 国、墨西哥和西班牙。柑桔黄龙病（Citrus huanglongbing，HLB）是由难人工培养的韧 皮杆菌（Cndidatus Liberibacter asiaticus） 引起的柑桔毁灭性病害。目前还没有获得该 病原菌的纯培养。新近的分子鉴定结果表明黄龙病罹病组织内除存在韧皮杆菌外，还存 在其它致病微生物：植原体或伴生微生物，并认为其可能是黄龙病植株症状表现复杂多 样的内在原因。本研采用常规分离培养技术与分子鉴定以及基于 16S rDNA 基因的 RFLP（Restriction Fragment Length Polymorphism）法，对柑桔黄龙病植株和健康植株的韧皮部内生菌区系进行比较分析，为研究柑橘植株韧皮部内生细菌与黄龙病菌之间的相互关 系奠定基础。利用分离培养的方法，根据菌落形态以及菌体形态共分离到 21 株柑桔韧皮部内生 细菌，对 21 株内生细菌进行形态和生理生化测定。经形态学鉴定和序列比对：菌株 WJ01， WJ02，WJ03，WJ05，WJ08，WJ12，WJ13，WJ16，WJ17，WJ18，WJ21 为芽孢杆菌属（Bacillus sp.），WJ04 和 WJ14 为假单胞菌属（Pseudomonas sp.），WJ06 为葡萄球菌 属（Staphylococcus sp.），WJ10 为考克氏菌（Kocuria sp.）。其中鉴定到种的部分菌株： WJ07 ：约氏不动杆菌（ Acinetobacter johnsonii ）、 WJ09 ：粘质沙雷氏菌（ Serratia marcescens）、WJ11：乳杆菌属草乳杆菌（Lysinibacillus graminis）、WJ15：微球菌属栖 息微球菌（ Miccrococcus sedentarius ）、 WJ19 ：产左聚糖微杆菌（ Microbacterium laevaniformans）、WJ20；极小短小杆菌（Curtobacterium pusillum）的特征。在健康柑橘 植株韧皮部中 Bacillus sp.、Pseudomonas sp.、Kocuria sp.为优势菌群。在 HLB 柑橘植株 韧皮部中 Microbacterium sp.、Bacillus sp.、 Pseudomonas sp. 和 Kocuria sp. 为优势菌。 且病株与健株相比，WJ19（Microbacterium sp.）的丰富度增加最为明显。利用 16S rDNA-RFLP 的方法分析柑桔内生细菌多样性。首先采用的保守性引物分 别扩增健康和罹病柑桔韧皮部总内生细菌 16S rDNA 中的高变区 V5、V6、V7、V8 及 V9，得到的片段长度约为 700bp。回收产物进行 T-A 克隆，健株与病株分别随机挑取 了 229，228 个阳性克隆子，进行 PCR 检测。提取阳性克隆子的质粒。含有的目的片 段的质粒分别用 MspⅠ，RsaⅠ，HaeⅢ 限制性内切酶进行酶切。鉴别分析各个阳性克 隆的酶切图谱类型，对文库中的所有克隆进行分型，不同的类型即是不同的分类操作单 位（Operational Taxonomic Unit，OTU）。将不同的 OTUs 进行测序。测序结果与 GenBank 中的序列进行同源性比较，结果显示：鉴定出 10 个属的细菌以及 11 个不可培养细菌，其中 9 个 OTUs 的序列与 GenBank 中的序列比对相似性 ≤ 97%，这些可能是还未经过序列测定过的新菌种。不同属的 RFLP OUTs 在健株（health plant，HP）与病株（infected plant，IP）的 16S rDNA克隆文库中所占的比率不同，分析结果显示：Dyella sp.（HP 27.08%；IP 25%），Enterobacter sp. （HP 3.93%；IP 0%），Serratia marcescens （HP16.16%； IP 18.86%），Enterococcus sanguinicola（HP 3.06%；IP 3.95%），Achromobacter sp.（HP 1.75%；IP 1.32%），Bosea sp. （HP 1.31%；IP 0.44%），Lysinibacillus fusiformis（HP 0%； IP 0.88%），Candidatus Liberibacter asiaticus（HP 0%；IP 3.07%），Bacillus sp.（HP 1.31%； IP 1.31%），Pseudomonas sp.（HP 17.03%；IP 17.54%），Uncultured bacterium clone（H