hiv 1 env 来源糖肽的表达 纯化及其阻断 hiv 1粘附的体外实验研究-expression and purification of hiv - env - derived glycopeptide and its in vitro experimental study on blocking hiv - 1 adhesion.docx

三峡大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。学位论文作者签名：日期：三峡大学研究生知识产权承诺书本人承认：我作为三峡大学硕士研究生在校学习期间，在导师指导下，依据研究工作所作学位论文的知识产权全部权归三峡大学所有。本人承诺：我有义务维护三峡大学的知识产权，凡是以我本人学位论文内的全部或部分研究成果，或实验数据为基础所形成的研究论文及成果，无论是以何种形式刊发学术论文、进行成果鉴定或申报奖励，均以三峡大学为第一作者单位或完成单位，并事先征得导师或学校相关部门的同意。我愿承担因违背上述承诺而引起的一切法津和经济后果。学位论文作者签名：日期：I内容摘要目的：在黏膜感染的过程中，HIV-1可以通过包膜蛋白表面的糖链与树突状细胞表面的C型凝集素受体DC-SIGN结合，从而促进病毒在宿主体内的播散。在前期研究中，我们发现一组来自HIV-1AE2f包膜蛋白的糖基化位点能够与DC-SIGN结合，具有潜在的阻断HIV-1与DC-SIGN结合的能力。为了验证其是否具有阻断HIV-1感染的活性，本研究构建了表达包含上述糖基化位点的短肽，并通过体外实验验证其拮抗HIV-1感染的能力。方法：(1)根据前期试验数据选取HIV-1（AE亚型）V4环区382/388糖基化位点，进行6次串联重复设计，加上病毒自身信号肽和6×His标签，命名为AE-Sexttet。序列交由上海捷锐生命科技有限公司合成。(2)将糖肽基因用BamHI/XbaI双酶切，克隆入真核表达质粒pSV1.0。将得到的质粒在293T细胞中表达，收细胞裂解液进行WB验证表达，并通过分子量判断糖基化程度。(3)构建DC-SIGN真核表达质粒并在293T细胞中表达，将表达DC-SIGN的细胞裂解液作为Lectin-Blotting结合液，与SDS后电转印至PVDF膜上的糖肽结合，通过检测结合到膜上的DC-SIGN判断糖肽的活性。(4)将糖肽基因构建到含Neo基因的载体pCDNA3.1(+)，构建糖肽稳定表达质粒。将质粒转染Hela细胞，G418抗生素筛选整合了重组质粒的阳性细胞克隆，建立稳定表达细胞系，通过RT-PCR和WB鉴定表达分泌型糖肽的阳性细胞系。(5)扩大培养稳定表达糖肽的单克隆细胞系，收取细胞培养上清，通过Lectin亲和层析的方式纯化糖肽，Western-Blotting验证纯化效果，Lectin-Blotting验证结合活性。(6)用TZM-bl细胞验证有、无糖肽的情况下，不同亚型HIV-1病毒进入细胞的情况，根据荧光素酶活性高低判断糖肽拮抗HIV-1假病毒粘附感染的生物学活性。结果：(1)瞬时转染后，Western-Blotting结果显示，目的蛋白的实际分子量远远大于预期分子量（前者为后者的约3倍）；Lectin-Blotting结果显示，瞬时表达的糖肽分子能够与DC-SIGN结合。(2)用重组pCDNA3.1(+)-AE-Sexttet质粒将糖肽基因导入Hela细胞并经过连续传代筛选之后，RT-PCR和Western-Blotting检测显示，分泌型糖肽稳定表达细胞株构建成功。(3)Western-Blotting结果显示，Lectin亲和层析纯化后的糖肽分子，分子量较均一（约40kDa）；并且能够部分阻断HIV-1假病毒向TZM-bl细胞表面粘附。结论：设计合成的糖肽基因可以在真核细胞中被正确表达并高度糖基化，并且能够部分阻断HIV-1假病毒粘附靶细胞。本研究提示：由哺乳动物细胞天然表达的、HIV-1膜蛋白来源的糖肽分子能够在HIV-1感染起始阶段的发挥一定的阻断作用。关键词：黏膜感染C型凝集素受体艾滋病病毒糖基化短肽IIAbstractObjectiveIthasbeensuggestedthatHIV-1couldsubvertDC-SIGNtofacilitateitsdisseminationinvivo.Inpreviousstudy,wefoundagroupofpotentialglycosylationsites(PNGs)onHIV-1AE2fEnvgotinvolvedinbindingwithDC-SIGN,whichsuggesteditmighthavepotentialcapacitytoblockinteractionbetweenHIV-1andDC-SIGN.Hence,inthisstudy,weexpressedashortpeptidecontainingthosePNGsinmamma