酶联免疫吸附测定-10年秋.pptVIP

酶联免疫吸附测定（Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA ） 周嘉 yuguomm@ 操作步骤 免 疫 荧 光 技 术 课程内容 ELISA的原理 ELISA的分类 间接ELISA的具体操作 ELISA在医学中的应用实例 ELISA的原理 1.抗原抗体反应的特异性 2.抗原或抗体的固相化 3.抗原或抗体的酶标记 间接ELISA 实验目的：测小鼠IgG免疫兔血清中抗小鼠IgG抗体的效价 实验材料：包被抗原：小鼠血清 待检抗体/一抗：兔抗小鼠IgG 酶标抗体/二抗：HRP-驴抗兔IgG 聚苯乙烯酶标板 水浴箱 移液器 枪头 包被液：pH9.6的碳酸盐缓冲液 封闭液/ 封：5%脱脂奶粉(ALB) 稀释液/稀： pH7.4 0.05M的PBS （磷酸盐缓冲液） 洗液：PBST（PBS+0.1%吐温20） 显色液：四甲替联苯胺(TMB) 终止液/终：2M硫酸 操作步骤 倍比稀释法与加样 操作步骤 酶催化底物液显色 DH2+ H2O2 D+ 2H2O DH2为供氢体， H2O2为受氢体。 DH2一般为无色化合物，经酶作用后氧化成为有色的产物。 结果的判定 肉眼判定结果：于白色背景上直接肉眼观察。颜色越深，反应越强；阴性反应为无色或极浅。根据颜色的深浅，以“＋”、“－”表示。 测定A值：在酶标仪上，根据不同底物设定波长（OPD底物为490nm，TMB底物为450nm），以空白孔调零后测各孔OD值。以高于阴性对照孔OD值2倍为阳性。 ELISA标准曲线 结果的判定 空白对照无显色，而样品显色明显且逐渐变浅 注意事项 对照的设定（阳性对照，阴性对照，空白对照） 倍比稀释时，要正确操作；加样时从低浓度向高浓度方向进行 终止反应的时间：以空白对照孔未显色为准 2M H2SO4具有腐蚀性，操作过程中应避免外溢 操作步骤 需要搞清楚的问题 1. 什么是免疫标记技术？为什么要进行标记? 三大免疫标记技术：放射免疫技术、荧光免疫技术、酶免疫技术。 2. ELISA的原理、定义及基本分类 3. 实验对照的设立及其意义 4. 了解ELISA在临床中的广泛应用 Company Logo * 包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜 封闭：5%脱脂奶粉，37 ℃ ，20min 加待检抗体：倍比稀释的兔抗鼠IgG抗血清，37 ℃ 25min 加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清， 37 ℃ 25min 加底物液显色 → → → → 洗涤：3次，1min/次 洗涤：3次，1min/次 洗涤：3次，1min/次 → 终止液终止显色（黄） 空白对照无显色 待测样品显色明显(蓝) E E E E 底物液 每种液体均加100ul／孔 封 一抗 二抗 无色避光 用示踪物质标记抗体或抗原，使其与相应的抗原或抗体反应，使微量的、不可见的反应成为可见的或可测定的。 用FITC-抗IgM单抗计数B细胞 E 阳性反应的最大稀释度为待测样品的效价。 鼠IgG(抗原) 兔抗小鼠IgG(一抗) HRP-驴抗兔IgG(二抗) 免疫 Fc段 包被：1：5000稀释的正常小鼠血清，4℃过夜 封闭：5%脱脂奶粉，37 ℃ ，20min 加待检抗体：倍比稀释的兔抗鼠IgG抗血清，37 ℃ 25min 加酶标抗体：1:5000稀释的HRP标记的驴抗兔IgG抗血清， 37 ℃ 25min 加底物液显色 → → → → 洗涤：3次，1min/次 洗涤：3次，1min/次 洗涤：3次，1min/次 → 终止液终止显色（黄） 空白对照无显色 待测样品显色明显(蓝) E E E E 底物液 每种液体均加100ul／孔 封 一抗 二抗 无色避光 A B 1 2 3 4 5 6 7 8