讲座四 基因诊断与基因治疗.pptVIP

讲座四 基因诊断和基因治疗 第一篇 基因诊断 基因诊断：即DNA诊断或分子诊断，是利用DNA或RNA为检测对象，从基因水平进行疾病诊断的方法。 1978 年美国学者首次采用羊水细胞对胎儿成功进行了血红蛋白病的产前基因诊断，开创了疾病基因诊断的新纪元。该方法被医学界称为第四代诊断技术。 基因诊断优势 属“病因诊断”，针对性强、特异性好。 灵敏度高，待测基因只需pg水平。 诊断范围广：基因探针来源、种类不受限制，序列已知、未知皆可，靶基因可以是特定基因也可以是一组基因，且内、外源都可。 同一个体内所有体细胞基因相同，无需对组织、器官或细胞进行选择。 靶基因活动与否都可，对具有组织和分化阶段表达特异性的基因可进行检测和诊断。 妊娠早期(8～12周)甚至受精卵植入前可进行基因诊断。 感染性疾病诊断中，可检测正在生长的病原体，也能检测潜伏的病原体；既能确定现行感染，亦能确定既往感染，可用于体外不易培养( 如产毒性大肠杆菌)及实验室不能安全培养(如立克次体)的病原体检测。 存在的问题 理论问题：目前找到的致病基因不多，由多基因及基因与环境互作所引发多种疾病的分子机制还不清楚。 技术问题：设备条件；操做人员；污染造成的假阳性。 伦理问题： 基因诊断的基本类型 临症基因诊断：医生根据患者病史、症状为明确或排除某一疾病而进行的检查。 症状前基因诊断：主要用于一些遗传病家系或有遗传病倾向的家系中，目前未发病，但有高度发病危险人群的诊断，特别适用于一些早期诊断后可进行预防性干预，避免出现严重不良后果的疾病。 产前基因诊断：又称出生前诊断，主要针对有生育患儿风险夫妇的胎儿进行诊断。对明确诊断为某种疾病的胎儿可采取干预措施，对目前尚无治愈可能疾病的胎儿可实施选择性流产。产前基因诊断采用的标本常为绒毛膜标本和羊水标本。 胚胎植入前遗传学诊断：适用于有生育患儿可能又不愿经产前诊断选择性流产的夫妇。常用的方法是待受精卵分裂至6～8个细胞的卵裂球阶段时，取其中1～2个细胞进行基因诊断，挑选正常胚胎植入母体。 第一节 基因诊断方法 直接诊断 基因测序是诊断基因突变的金标准，但实际工作中不可能对疑有突变的标本逐一做基因测序。 杂交和PCR技术是直接基因诊断的两大基本技术。 杂交技术：对于需要对DNA或RNA进行定位检测或为染色体异常的疾病，常采用杂交技术，包括荧光原位杂交(FISH)、Southern杂交、反向点杂交等。 PCR检测：标本中靶DNA含量较低不易直接检测突变基因时，可采用 PCR扩增后再检测。常用的方法有：常规PCR、RT-PCR、实时定量PCR、等位基因特异性PCR等。 实际工作中常将多种检测技术联合起来使用。 间接诊断 当基因结构不清或结构复杂或突变过多而无法逐一检测，利用与某种疾病基因紧密连锁的多态性标记来判断待检者是否带有某一致病基因。 第一代多态性标志是限制性片段长度多态性(RFLP)。第二代是数目可变的串联重复序列(VNTR)和短串联重复序列(STR)。第三代是单核苷酸多态性(SNP)。 多态性标记的应用受到多态信息含量和基因重组等因素的影响；但第三代标记SNP的多态信息含量丰富，结合芯片技术在一些复杂疾病的诊断中发挥了重要作用。 一、基因诊断中常用的分子生物学方法： 核酸杂交： PCR： 限制性内切酶长度多态性(RFLP)分析： DNA序列测定： DNA芯片技术： 核酸分子杂交： PCR：一般与其它技术合用。 单链构象多态性(SSCP)检测：PCR-SSCP，点突变检测。 限制酶酶谱分析：基因突变导致酶切位点的丢失或相对位置发生改变。 DNA序列测定： DNA芯片技术： 二、基本方法： 基因变异致病的类型： 内源基因的变异： 基因结构突变：点突变、插入、缺失、重排、易位等。 基因表达异常：mRNA剪接异常。 外源基因的插入：如病毒基因的插入。 (一) 基因突变的诊断： 1.点突变的诊断： 诊断已知的点突变(PCR-ASO)：一对探针，突变碱基置探针中央，控制杂交条件，结果分析。 基因芯片技术：可检测出新的突变类型。 诊断未知的突变 ：PCR/SSCP/测序。DNA芯片技术。 等位基因特异性寡核苷酸(allele specific oligonucleotide, ASO)探针斑点杂交：诊断已知点的突变，分别合成野生型和突变型探针，诊断时只需用PCR扩增受检者目的DNA片段(PCR-ASO)，再分别与上述探针杂交，杂交的结果有如下几种情况。 PCR扩增产物与正常探针杂交，不与突变探针杂交；不 存在所检测的突变。 只与突变探针杂交：突变基因为纯合子。 与正常探针和突变探针都可杂交：突变基因为杂合子。 与正常探针和突变探针都不能杂交：突变基因不属于已发现的类型。 单链构象多态性(single strand confor