第3章-原生质体培养与体细胞杂交2010.pptVIP

第三章 原生质体培养 和体细胞杂交 第一节 原生质体培养 一、原生质体研究概况 （一）原生质体的概念 原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或一个被质膜所包围的裸露细胞。 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体叫亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。 核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。? 胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。 （二）原生质体研究进展 植物原生质体培养研究中的几个重要成就：? 1880年，Hanstein首次起用原生质体(protoplast)一词。 1960年，Cocking首次应用酶法制备番茄根原生质体获得成功。 1971年，Takebe等首次得到烟草叶肉原生质体培养的再生植株。 1981年，Vardi等获得柑橘胚性愈伤组织原生质体培养再生植株。 1985年，Fujimura等获得第1例禾谷类作物－水稻原生质体培养再生植株。 1986年，Spangenberg等单个原生质体培养再生植株在甘蓝型油菜上获得成功。 目前几乎所有植物都可以获得原生质体培养再生植株。 二、原生质体分离 （一）原生质体分离的材料准备 生长旺盛、生命力强的组织和细胞是获得高活力原生质体的关键，并影响桌原生质体的复壁、分裂、愈伤组织形成乃至植株再生。 无菌试管苗叶片 萌发种子的上胚轴和子叶 ? 愈伤组织和悬浮细胞 （二）预处理及酶解 2）. 酶溶剂及其渗透压 ? 酶溶剂：酶液中加入的一些化学物质，以提高酶解效率或增强酶解原生质体的活力。CaCl2、葡聚糖硫酸钾、 BSA 、 MES等。 ? 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。 3) 其他条件： 酶解效果还与以下因素有关： 酶液浓度: 1g组织/10ml酶液 酶解时间：暗（或弱光）0.5~20h 酶解温度: 23~28℃ 酶液PH值：4.7~6.0 4）原生质体分离方法（葡萄为例）： A. 取材：无菌条件下，将材料切成1mm2小块或1mm切段。 B. 按下表配好酶液：酶液要用滤膜过滤灭菌。分装-20℃保存 C. 酶解处理：将植物材料放入酶液中（0.5~1.0g/10ml酶液），真空抽气5’。于摇床上（30~40r/min)，26℃酶解处理2~8h. D. 过滤：50~70um镍丝网。 撕下表皮 三）原生质体收集和纯化 1.沉降法（离心法）：利用比重原理，低速离心使原生质体沉于底部。75-100g离心3-5 分钟，弃上清，再用液体培养基或13%甘露醇悬浮洗涤，重复2-3次。 (四）原生质体活力测定 1.原生质体活力测定方法： 目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。有活性的颜色鲜亮，形态规则完整，富含细胞质。? FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可在荧光显微镜下通过具荧光细胞的观察确定细胞活性。 伊文斯蓝法：伊文斯蓝（Evans blue)不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏使，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。 2.影响原生质体活力的因素 分离材料的生理状态 ? 酶解条件：酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压、酶溶液的PH值 ? 分离条件：离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间 ? 环境条件：操作环境的温度、分离用具的影响 三、原生质体培养 （一）原生质体培养基 1．无机盐 大量元素浓度； NO3－和NH4+的比例； Ca2+浓度 ? 2．有机成分? 维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。 3. 激素? 常用的激素：NAA、IAA、2,4-D 、BA、ZT等 4. 渗透压?稳定剂 在原生质体培养时，必须使其处于一个等渗或低于细胞内渗透压的外界环境。 常用的渗透压调节剂：甘露醇、山梨醇、蔗糖和葡萄糖等。 5. PH值 原生质体培养基的PH值一般在5.5-5.9。 （二）原生质体培养方法 1. 液体浅层培养:Liquid thin layer culture 将含有原生质体的培养液在培养皿底部铺一薄层，封口后进行培养。 优点：操作简单，对原生质体的损伤小，且易于添加新鲜培养基和转移培养物。 缺点：原生质体分布不均匀，常发生原生质体粘连现象而影响其进一步生长和发育。难以跟踪观察某一个细胞的发育情况。 2.固体平板培养:Solid culture 固体培养也就是琼脂糖包埋培养。低融点琼脂糖可在30?C左右融化与原