bodipy类荧光试剂测定巯基化合物的分析word格式论文.docxVIP

摘要巯基(-SH)是细胞中化学活性最高的基团。巯基化合物在调节细胞氧化还原平衡、保护生物膜系统、抗氧化应激和抗氧化损伤等方面具有非常重要的作用。研究表明,生物体中巯基化合物含量的异常也与许多疾病有关。此外，小分子硫醇化合物是重要的工业生产原料,可能引起环境污染问题。随着巯基化合物在生物体系和环境中的重要影响被逐渐认识,鉴别和定量测定巯基化合物日益受到关注。因此发展高灵敏、易操作、快速的巯基化合物分析方法具有十分重要的意义。由于小分子巯基化合物一般不发光也不具备生色团，所以需采用化学衍生技术进行衍生，生成有强荧光的物质，以达到高灵敏度检测的目的。本文利用荧光探针与巯基化合物衍生后，再分别采用毛细管电泳-激光诱导荧光检测法（CE-LIF）和高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FL）分析测定生物样品和环境样品中的巯基化合物，并对细胞中的巯基化合物进行荧光成像分析。主要研究内容如下：（1）建立了以N-（4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-3a,4a-二杂氮-s-葵烷-2-甲基）碘乙酰胺（BODIPY?507/545 IA）为柱前衍生试剂，高效液相色谱-荧光检测和毛细管电泳-激光诱导荧光检测法测定半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽三种物质的方法。研究表明，使用HPLC-FL 测定半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽，三种分析物在20 min 内达到基线分离，检出限（S/N=3）分别为5、10和5nmol/L；用CE-LIF测定半胱氨酸、高半胱氨酸和谷胱甘肽，三种分析物在9min内达到基线分离，检出限（S/N=3）为0.5nmol/L。相关系数在0.9967-0.9991之间，线性关系良好。采用HPLC-FL和CE-LIF两种方法检测血浆和尿液样品的加标回收率分别在93.8-108.1%和93.5-107.2%之间。（2）建立了以1,3,5,7-四甲基-8-溴甲基-二氟化硼-二吡咯甲烷（TMMB-Br）为柱前衍生试剂，高效液相色谱法测定巯基乙醇、丙硫醇和丁硫醇三种小分子巯基化合物的方法。详细优化了分离条件和衍生条件。三种巯基化合物在45℃下，15min即可完成衍生反应。巯基乙醇、丙硫醇、丁硫醇的检出限（S/N=3）分别为5、10和10nmol/L。分析物的峰面积和迁移时间的相对标准偏差（RSD）的范围分别在0.39-2.31%和0.19-0.83%之间。成功应用于水样中巯基化合物的测定，加标回收率在95.9-105.7%之间。该方法具有灵敏度高、操作简单、重现性好等特点。I（3）以N（-4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-3a,4a-杂氮-s-葵烷-2-甲基）碘乙酰胺（BODIPY?507/545IA）为衍生试剂，在模拟生物环境中,研究了BODIPY?507/545 IA 对细胞破碎液中半胱氨酸的响应。探针与半胱氨酸响应的荧光强度与半胱氨酸的浓度的线性关系良好，线性相关系数R2=0.9948。在细胞环境中，用显微镜观察，探针能快速地与细胞内巯基化合物结合发出强荧光。该探针具有良好的光稳定性、低毒性和生物兼容性。运用HPLC-FL定量测定了HepG2肝癌细胞中的三种巯基化合物，建立了一种实时检测与定量检测相结合的分析细胞中巯基化合物的方法。关键词：巯基化合物、N-（4,4-二氟-1,3,5,7-四甲基-3a,4a-二杂氮-s-葵烷-2-甲基）碘乙酰胺（BODIPY?507/545IA）、1,3,5,7-四甲基-8-溴甲基-二氟化硼-二吡咯甲烷（TMMB-Br）、毛细管电泳-激光诱导荧光检测法（CE-LIF）、高效液相色谱-荧光检测法（HPLC-FL）、荧光成像IIAbstractSulfhydrylgroup(-SH)isthehighestchemical activity group in cells.Thiol compounds playtheessentialroleinregulatingcell oxidation-reduction equilibrium, protecting the biofilmsystem,resistingtotheoxidativestressandoxidationdamageandsoon.Numerousstudieshaveshownthattheabnormollevelsofthethiolsinphysiologicalliquidscloselyassociatedwith severaldiseases.Thiolcompoundswithlow-molecular-weightarealsoimportantindustrialrawmaterialsthatmightcauseenvironmentalpollutionproblems.Moreandmore att