aml1新伙伴基因检测及其断裂位点鉴定word格式论文.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 前 言 急性髓系白血病（Acute Myeloid Leukemia, AML）是造血干细胞恶性增殖的单克隆性 异质性疾病，以细胞分化阻滞、骨髓或外周血中粒系或单核系祖细胞积聚为特点。AML 的确切病因至今未明，但非随机性特征性染色体易位在白血病的发病机制中发挥了重要的 作用[1]。WHO 分类标准认为，AML 中染色体异常具有相近的生物学发病机制，从而使细 胞遗传学异常成为 AML 分层治疗的重要依据[2]。有资料表明，细胞遗传学异常发生于 56% 急性髓性白血病（AML），其中 AML-M0、AML-M1 和 AML-M2 发生率分别为 71%、49% 和 53%[3]。 染色体易位导致的分子事件是两个基因的断裂融合，如t(8;21)导致AML1/ETO的形成。 AML1（Acute Myeloid Leukemia 1）是急性白血病中较常见的一种易位靶基因。AML1位于 21q22，主要形成t(8;21)，发生于40%AML-M2和12~15%初发AML，偶见于M0、M1、M4[4]。 该易位中，21号染色体上AML1基因前5???外显子与8号染色体上几乎全部的ETO基因融合， 形成AML1/ETO。ETO基因断裂主要发生在两个位点，即内含子1 和内含子2[5]。AML1/ETO 融 合基 因 除源 于 t(8;21) 外 ， 还 在 一 些 ins(21;8) 和 ins(8;21) 病 例 中 观察 到， 插 入 产 生的 （5AML1/3ETO）有多种断裂位点，插入片段长度在2.4到44Mb之间[6]。 t(8;21)还形成多种复杂易位。Farra C 等[7]2004 年报道一例 AML-M2 病例有 t(8;12;21) (q22;p12 approximately p13;q22)易位，同时包含 Y 染色体缺失和 8q22 长臂末端三体。Huang L 等 [8]2006 年 报 道了 四 例 AML 具 有复 杂易 位 ，分别 为 ins(8;21)(q22;q22q22), t(1;21;8)(q25;q22;q22), t(8;11;21)(q22;q13;q22), 和 t(4;21;8;12)(q31.3; q22;q22;q15)。除此之 外，现确定的 AML1 相关的染色体易位还有 1p36 、2p11.2、2q21、3q26、4q21、5q13、 6p22、8q13、8q24、9p21–p22、10q21、12p13、12q23–24、14q13、14q22、14q24、15q21–q22、 16q24、17q11.2–12、18q21、19q13.4、20q13.1 等[9]。 基因融合事件的发生通常在两个层面进行检测，一是细胞遗传学检测，即以染色体为 主体的显带技术及荧光原位杂交技术（Florescence In-Situ Hybridization, FISH）；一是以 mRNA为主体的RT-PCR检测技术。 常规染色体检测可以发现多种染色体异常，如t(8;21)，t(15;17)，t(9;22)等，但由于白 血病细胞特性的影响，染色体分裂相少且难以得到长度适中的染色体中期分裂相，使得难 以判断是否存在断裂易位。即使是很有经验的实验室也常有5%-10%的病例染色体培养失 败，特别是对于染色体微小易位、小片段缺失、重复或倒位更是无法检出。这种情况下， 国外常采用FISH方法进行鉴定，但其对于未知染色体异常病例，常需多种探针进行筛选， 成本高，周期长，不适合常规检测。 逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）技术，灵敏度较好，是目前融合基因检测的主要方法， 但由于融合基因断裂位点的多样性以及伙伴基因的复杂性，使得常规RT-PCR方法无法检测 到全部的易位类型，且难以检测到新的未知基因的断裂融合。 在导师带领下，根据大量已报道的融合基因，分析 AML1 基因的断裂特点，建立了一 种快速检测 AML1 断裂融合事件的新方法，即 B/C 比值法，该方法已申请了国家专利。在 此方法上，我们筛选出 21 例可能携带有 AML1 伙伴基因的可疑病例。 对 RNA 结构进行分析时，一般先通过 RT-PCR 反应扩增目的区域，然后再对扩增出的 目的 DNA 片段进行克隆、序列分析等，而一般的 RT-PCR 反应很难得到全长的 cDNA 片 段。RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）法能有效解决这一问题。3’-RACE 能够通 过已知的 cDNA 序列，扩增出 cDNA 的 3’末端的全长序列。因此，通过 3’-RACE 法，对 可疑病例进行检测，可以发现异常条带，测序后有哪些信誉好的足球投注网站 Genebank 数据库，分析