ampkmtor介导有氧运动提高骨骼肌胰岛素敏感性的机制研究word格式论文.docx

学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的论文是我个人在导师指导下独立进行研究工作取 得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容和致谢的地方外，论文中不 包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果，与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。学位论文作者签名：日期：年 月 日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解天津医科大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，并采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家有 关部门或机构送交论文，并编入有关数据库。本论文属于必威体育官网网址在年解密后适用本授权书。不必威体育官网网址√。（请在相对应的方框内打―√‖ ）学位论文作者签名：日期：年月日 导师签名 ：日期：年月日中文摘要研究目的：有氧运动能够增加机体能量代谢水平，并且作为一种既经济又实用的治疗 干预手段越来越引起人们的重视，已应用于临床胰岛素抵抗 (Insulin Resistance, IR) 和代谢性疾病的预防和治疗。但是，目前对于有氧运动调控骨骼肌能量代谢 在改善 IR 中作用机制认识上的不足严重妨碍了运动疗法在临床的广泛应用。哺 乳 动 物 细 胞 一 磷 酸 腺 苷 活 化 蛋 白 激 酶 (AMP-actived Protein Kinase, AMPK) / 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白 (Mammalian Target of Rapamycin, mTOR) 信号通路是机体组织细胞能量和营养素调节的重要途径，在机体肥胖和 IR 等 代谢性疾病的发生发展过程中发挥重要调节作用。大量研究证实，AMPK/mTOR 信号通路还是一条运动敏感型通路。因而本研究试图揭示 AMPK/mTOR 信号通 路活性在有氧耐力运动改善小鼠胰岛素抵抗中的作用和分子生物学机制。mTOR 可以通过调节脂肪酸的合成代谢过程对细胞的代谢稳态产生影响。 与此同时，研究发现细胞可以通过 AMPK/mTOR 信号通路对生长因子、营养素 水平、应激以及胞内能量状态等信息进行整合，参与细胞自噬 (Autophagy) 活 性的调节。另外，Sestrins 是近年发现的高度保守的细胞应激诱导蛋白，可在氧 化应激状态下通过清除细胞内氧化自由基 (Reactive oxygen species, ROS) 的堆 积而发挥细胞保护作用，并且与细胞 AMPK/mTOR 信号通路活性有着密切联 系。因而本研究从 AMPK/mTOR 参与的脂代谢和自噬调节两方面探讨其在有氧 运动改善 IR 中的作用和分子生物学机制。研究方法：本研究于在体、离体两方面同时开展研究，探讨 AMPK/mTOR 信号通路在 骨骼肌细胞脂肪酸代谢和自噬活性调控中的作用及其在有氧运动改善 IR 中的 相关作用机制。1.动物模型的建立5 周龄 C57BL/6 小鼠随机分为正常饮食组 (NC) 和高脂饮食组高脂饮食组 喂养高脂饮食 10 周后建立 IR 模型。随后将高脂饮食组再次随机分为高脂饮食 安静组 (HC) 和高脂饮食运动组 (HE)。2. 代谢表型的检测I本课题采用 ELISA 法检测空腹血清胰岛素值；酶法检测小鼠血清总胆固醇(TC) 以及甘油三酯 (TG) 水平；口服葡萄糖耐量 (OGTT) 检测小鼠葡萄糖耐 量。3.基因芯片分析骨骼肌基因表达谱分离各组小鼠股四头肌后，提取总 RNA，经荧光标记后进行芯片杂交，利 用芯片扫描仪记录荧光信号，并采用相关软件对所得数据进行统计学分析。 4．细胞培养及干预方案小鼠肌原细胞系 C2C12 经 2% 马血清培养诱导分化为肌管细胞。使用游离 脂肪酸棕榈酸酯 (Palmitate) 刺激细胞；采用 siRNA 抑制 S6K1 表达；使用 Rapamycin 抑制细胞 mTORC1 活性；转染 GFP-LC3 表达质粒，观察细胞自 噬水平；使用 3-MA 抑制细胞自噬活性。5．生化指标检测采用 Real-time PCR 检测基因表达；采用 Western Blot 方法检测蛋白表达； 使用 2-脱氧葡萄糖荧光类似物 (2-NBDG) 检测骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力；使 用免疫共沉淀 IP 检测蛋白间的相互结合。研究结果：1.长期高脂饮食及运动对 C57BL/6 小鼠代谢的影响HC 组小鼠体重、血清空腹胰岛素、血清甘油三酯、以及总胆固醇水平显著 高于 NC 组小鼠；而 HE 组小鼠 6 周的有氧运动干预则显著逆转了这一趋势。 OGTT 结果表明，长期高脂饮食引起 HC 组小鼠葡萄糖耐量显著降低，而 6 周 有氧运动干预后 HE 组小鼠则相对 HC 组有显著改善。采用基因芯片研究长期高脂饮食和有氧运动对小鼠骨骼肌基因表达谱的影 响。通过对数据