第三章离体培养的操作技术.pptVIP

扎口与灭菌: 要求封口松紧适宜，系活扣， 便于接种操作。 培养基应及时灭菌，防止变质。 三、无菌技术 灭菌是组织培养重要的工作之一。 要建立有菌和无菌的概念，即必须准确识别哪些东西是有菌的，哪些东西是无菌的，并掌握灭菌方法及其适用范围。 灭菌是组织培养重要的工作之一 原因： 1. 培养基含有丰富的营养物质，非常适合微生物的生长。 稍不小心就会引起杂菌污染，微生物一旦接触培养基， 其生长速度一般都比培养的组织快很多，并且杂菌的繁 殖速度极快，大量消耗培养基的营养。 2.这些污染微生物还可能分泌和排泄一些对植物组织生长 和代谢有毒作用的代谢物，使培养的植物组织难以正常 生长，严重时引起植物组织坏死或失去培养价值。 因此，在培养容器内保持一个完全无菌的环境是绝对 必要的。 有菌的概念：凡是暴露在(未经处理的)空气中的物体，曾经接触过自然水源的物体，至少它的表面，毫无例外都是有菌的。 这里所指的菌，包括细菌、真菌、放线菌、藻类及其它微生物。菌的特点是：极小，肉眼看不见。无处不在，无时不有，无孔不入。在自然条件下忍耐力强，生活条件要求简单，繁殖力极强，条件适宜时便可大量滋生。 有菌 与 无菌 无菌的概念：经过高温灼烧或蒸煮过足够时间后的物体，经其他物理的或化学灭菌方法（当然这些方法必须已经证明是有效的）处理过的物体，有可能是无菌的。 主要内容 培养基灭菌 器皿试材和接种用具的灭菌 培养室和接种室的灭菌 无菌操作 1、无菌室 即培养室和接种室的灭菌 室内灭菌可用 2％新洁尔敏檫洗 75 ％酒精喷雾 UV照射20分钟 2、培养基 灭菌方法有： 高温高压蒸汽灭菌 121℃，1.1Kg/c㎡，15-20分，时间过长，培养基成分易变性失效 过滤灭菌 在高温高压下易分解的培养基和激素类。 高压蒸汽灭菌（湿热灭菌） 原理是利用高温蒸汽实现灭菌，在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。高压是为了提高温度和缩短灭菌时间。 利用高温灭菌效果好，可有效缩短灭菌时间，一般设定121℃（压力0.1～0.15MPa ），灭菌时间15～20min。 容器体积(mL) 121℃灭菌所需最少时间(min) 20-50 15 1000 30 250-500 25 75-150 20 培养基高压蒸汽灭菌所必需的最少时间 过滤灭菌 原理：空气或溶液通过过滤膜后，细菌的细胞和孢子直径等因大于滤膜孔径而被阻，而被过滤的气体或液体顺利通过滤膜，从而使滤过的空气或液体实现无菌状态。 分类： 空气过滤灭菌：用于形成无菌的操作空间 液体过滤灭菌：用于对高温、高压不稳定的物质 的灭菌，特别是遇热易分解的物 质的灭菌 3、器皿和接种用具的灭菌 解剖刀、镊子、剪刀等用具采用干热灭菌法，用烘箱灭菌，120℃时1小时。也可采用灼烧灭菌法。 干热灭菌是利用烘箱进行烘烤来杀死微生物。 原理是利用高温的烘烤实现灭菌，灭菌温度与灭菌时间成反比，即温度较高时，灭菌时间较短。（150℃40min或120℃ 120min） 玻璃器皿（如三角瓶、培养皿等）、金属操作器械（剪子、镊子、解剖刀、接种针等）均可用高温干热灭菌。 干热灭菌的物品要预先洗净、干燥、妥善包扎，以免灭菌后取用时重新污染。 灼烧灭菌 利用酒精灯烧灼以达到灭菌的目的。 方法：在酒精灯的外焰上灼烧充分，一般达到尖端部分烧红为止，可有效杀菌。 金属操作器械（剪子、镊子、解剖刀、接种针等）可以采用该法灭菌 4、外植体的灭菌 原则： 充分灭菌，但不伤外植体 不同的外植体，灭菌的要求也不一样 二、培养基配