PCR原理06级用此稿讲.pptVIP

一、多聚酶链式反应教材204页   多聚酶链式反应(PCR , Polymerase chain Reaction）是20世纪80年代发展起来的一种快速的DNA特定片段体外合成扩增的方法。  在模板DNA （即目的基因） 、引物和四种脱氧核苷酸存在下，利用耐热DNA聚合酶经过高温变性、低温退火和中性延伸三个阶段的反复作用，是微量的模板DNA在几小时内扩增106 ~ 109倍。小时内扩增106 ~ 109倍。PCR的过程分以下三步循环反应 ： PCR的过程分以下三步循环反应 ：  1.变性 通过加热 90～95℃变性使 DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。  2.退火 当温度降低550C时，由于引物量大大多于模板DNA，几乎所有的单链DNA模板均与引物在互补区形成杂交链。  3.延伸 在约700C条件下，DNA聚合酶以dNTP为原料，以两条引物为复制的起点，在两条模板链上合成新的DNA子链。 如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中性延伸三个阶段。  PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。  2.退火（复性）  当温度降低约 55℃时两条引物链在低温下分别于两条模板互补，由于引物DNA量大大多于模板DNA，几乎所有的单链DNA模板均与引物在互补区（形成局部双链）形成杂交链。 以三次改变温度为一个循环，每一次循环就是欲扩增的DNA区段的拷贝数放大一倍，即第一次循环，每条模板双链DNA变为两条； 第二次循环，则变为四条；第三次循环，变为8条……以几何级数扩增下去。一般样品经30次循环，最终是特定DNA片段放大了数百万倍。 PCR product 二、PCR反应五要素 引物（primer）— DNA 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium） 1. 引物 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 4. dNTP 的质量与浓度 dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 在PCR反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低 5. 模板（靶基因，target gene） 提取的核酸即可作为模板用于PCR反应 一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。 6. Mg2+浓度 Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0 mmol/L为宜 三、PCR反应条件的选择 PCR反应条件: 温度 时间 循环次数 1. 温度与时间的设置 以下9片不介绍,接应用 设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在90～95℃变性，再迅速冷却至40 ～60℃，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至70～75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。 ① 变性温度与时间 变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性 若低于93℃则需延长时间 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败 ② 退火(复性)温度与时间： 退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。 变性后温度快速冷却?至40℃～60℃，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞。 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的