基因工程（研究生）.pptVIP

基因克隆技术概论 clone技术有三个层次 整体水平：克隆羊多莉的出现 细胞水平：制备单克隆抗体时 分子水平（即分子克隆）：即制备 DNA片段，通过载体导入受体细 胞，在受体细胞中复制、扩增，以 获得单一DNA分子的大量copy. M13噬菌体的最大优点是噬菌体颗粒中所含的是 单链DNA，该单链DNA可作为模板用于DNA序列 分析，利用单链M13克隆可制备成单链DNA探针 用于杂交分析，检测DNA或RNA，或者作为基因 定点诱变的载体。噬菌体成熟后钻出宿主细胞而 不破碎细胞，可以从细菌培养液的上清液中获得 噬菌体，制备单链DNA，而双链噬菌体DNA可通 过裂解细菌进行制备。 转录终止和加poly(A)：真核基因表达的过程中，RNA 聚合酶Ⅱ通常跨过poly(A)位点继续进行转录，因此，成 熟的mRNA3? 端是经过位点特异性的转录后切割并加上 poly(A)而形成的。 准确而有效地加上poly(A)，有赖于mRNA中不同的序 列，一是位于poly(A)位点下游的GU富集区或U富集区， 二是poly(A)加尾信号：AAUAAA。真核表达载体必须带 有poly(A)位点下游序列，以保证新转录的mRNA能够有 效地加上poly(A)。 第三节、重组DNA的基本过程 插入灭活法筛选重组体 （四）用核酸杂交法进行分析鉴定： 为了进一步鉴定重组基因体中的目的基因，可采用与目的基因部分互补的DNA片段作为探针，与含有重组体的细菌菌落进行杂交，经放射自显影，如结果为阳性，即可确定重组体中带目的基因。 第四节 真核细胞转染 一、真核细胞转染的基本方法和原理 （一）磷酸钙共沉淀法 （calcium phosphate co-precipitation） 外源DNA或重组DNA 磷酸钙 微小颗粒 + 宿主细胞 颗粒沉积在细胞表面 利于宿主细胞摄取 （二）电穿孔法：同原核细胞 第五节 克隆基因的表达 原核基因在原核细胞中表达 真核基因在原核细胞中表达：E.coli是最成功 的原核表达体系 克隆基因的 表达分为四 原核基因在真核细胞中表达 种 真核基因在真核细胞中表达 第六节 目的基因的定点诱变及其应用 基因定点诱变(site-directed mutagenesis)是指将基因 的某一个或某些位点进行人工替换或删除的过程。这 些方法已成为蛋白质工程中定向改变基因结构的主要 方法。 一、基因定点诱变技术 (一)寡核苷酸介导的定点诱变法 用于删除或置换DNA 片段中的核苷酸。例如，可以用来改变蛋白质编码序 列的个别密码子，从而改造蛋白质的结构；或使具有 调控功能的序列发生变化，以确定DNA特定的功能区 域。而且还可以利用寡核苷酸介导的诱变构建新的载 体或嵌合基因。例如可在表达载体中预先选定的位置 上，插入诸如核糖体结合位点或聚腺苷酸化(加polyA 尾)信号等序列；又如在指定位置上除去某种限制性酶 切位点并加入便于使用的限制酶切位点； 原理：利用Klenow片段延伸与单链环状DNA模板相 配对的寡核苷酸引物，这个寡核苷酸引物除了有一 处与模板的碱基错配外，其余部分全部与模板互补 ，由此寡核苷酸的错配处诱发突变，并在体外新合 成一个杂合双链DNA，最后用T4DNA连接酶将新合 成的杂合双链DNA连接成双链闭环DNA分子。将体 外合成的杂合闭环DNA转化到大肠杆菌细胞，由于 单链环状DNA复制的特点，就会同时产生野生型与 诱变型两种DNA分子。最后通过筛选，将诱变型 DNA分子筛选出来。 含有诱变位点的寡核苷酸引物的长度一般为20～