CH6-基因文库的构建与目的基因.pptVIP

直接测定重组子核苷酸序列，根据核苷酸序列制备探针。适用于：在某些特定的细胞类型或组织，当中某种特殊的mRNA的含量格外丰富。总RNA反转录构成的cDNA文库，只要直接测定少量 的重组体分子的核苷酸序列，即可筛选出高mRNA丰度基因的cDNA克隆。尔后就可用这些 cDNA作探针，进一步筛选基因组文库。 高度保守的基因制备探针。适用于：核酸的种间杂交成为可能。从某种生物实验体系中分离到的基因序列，可作为从其它生物中分离相关基因的核酸探针。 根据蛋白质家族保守序列分离相关基因。适用于：同一蛋白质家族内。 探针的制备 2. 菌落或噬菌斑杂交 OR ANTIBAODY ????用已知序列的基因的筛选保存于 384 孔培养板的大片段 DNA 文库时，还可以采用更加简单快捷的方法——混合池 PCR 筛选法。一旦混合池构建好以后， PCR 筛选将非常方便，每天可以做大量的 PCR 反应，筛选大量的标记。 PCR 筛选法还有一个很大的优点是可用 SSR 引物从文库中筛选阳性克隆，而核酸杂交法却不能以 SSR 序列为探针筛选阳性克隆。 3. PCR筛选法： 4.表达文库的免疫学筛选： 1、特异性鉴定： 荧光抗体法 免疫沉淀法 免疫印迹法 ELISA 2、生物学活性鉴定 Figure 10.12 WESTERN BLOTING HYBRIZATION 5. 合成寡核苷酸探针： 有时候我们只知道待分离的目的基因的蛋白质编码产物，而对其核苷酸序列一无所知，因此也就没有现成的核酸探针可用来筛选克隆的基因。在这种情况下，可以按照测定的蛋白质氨基酸序列资料，设计合成寡核苷酸探针以资使用。但以这种方式合成寡核苷酸探针，存在着有待克服的两个实际困难。 第一个困难是，所合成的寡核苷酸探针必须严格地只能同目的基因的cDNA序列互补，而不会同其它无关的cDNA序列互补。据推算，能够满足这种苛刻条件的寡核苷酸 探针，其长度至少得有15 ~16个核苷酸。而且实际上为保证有足够的特异性，通常使用 的寡核苷酸探针的长度是17~20个核苷酸。由此可见，我们起码得掌握一段由6个连续排列的氨基酸组成的蛋白质序列的数据。 第二个困难是，遗传密码的简并(degeneracy)问题。根据蛋白质氨基酸组份合成的寡核苷酸探针，通常是混合物的形式。而在这种寡核苷酸探针库中，只有一种探针具有正确的核苷酸序列结构，能同cDNA文库中的目的基因完全杂交。 二、未知序列基因的分离 Identifying the gene associated with a specific disease requires years of work. The first step is to identify the region of the chromosome the gene is in (pedigree analysis, identifying breaks in chromosomes which cause the disease, etc.) Once the gene has been localized to a region of a chromosome, is to “walk” along the chromosome. The walk starts at a sequence known to be nearby, and continues until the gene of interest is located. （一）Finding a Gene: Chromosome Walking 在克隆基因组基因时，已知该基因在染色体上的位置但没有该基因的序列信息，无法制备相应的探针，因此无法直接筛查文库去克隆基因。此时，如果知道离开该基因一定距离上的DNA序列，则可用这个DNA序列作探针，通过染色体步移来逐步接近并最后达到待克隆的基因。 其基本原理是用探针筛查文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列)作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列)是重叠的，共有的。也就是这两个片段是在同一条染色体上相互邻接的。于是，再用新得的插入片段的末端部分作为探针，再去筛查文库。通过一系列的操作，得到的插入片段逐渐连接延伸，最后可以步移到待克隆的基因。当然，在具体操作过程中还必须设计具体的方法，如同时构建跳步文库(jumping library)和连接文库(linking library)等，使插入片段朝着一个方向步移。 Chromosome walking uses large cloned DNA fragments which overlap. Clon