ch7,8-受体细胞重组子的筛选1.pptVIP

* 转基因烟草的PCR检测电泳图谱 其中 M: DL2000； (+)：内含目的基因的质粒为模板，作阳性对照； (-)：野生型烟草基因组DNA为模板，作阴性对照； 1-5：转基因烟草基因组DNA为模板。 结果表明：3号为非转基因烟草，而1，2，4，5为阳性转基因烟草。 特异引物扩增条带长为750bp。 M (+) 1 2 3 4 5 (-) M M (+) 1 2 3 4 5 (-) M AFLP (amplified fragment length polymorphism： 酶切位点扩增片断长度多态 第三节　核酸分子杂交法 一、菌落噬菌斑原位杂交法 菌落或噬菌斑原位杂交法的工作原理是根据克隆的目的基因或DNA片段的同源序列设计并合成探针，以此搜寻筛选含有目的基因的目的重组子。其中，DNA同源序列之间的特异性互补杂交是该技术的基本理论依据。 Go 核酸杂交 二、斑点印迹杂交 三、Southern印迹杂交 第三节　核酸序列分析 DNA序列测定是精确鉴定目的基因的重要手段，目前国际上流行采用Sanger发明的双脱氧末端终止法测定DNA序列，其工作原理是在DNA聚合反应的进程中，通过位点特异性终止测定DNA序列。 第四节　基因产物检测 Cell free translation Linked in Vitro Transcription and Translation Procedure Using Rabbit Reticulocyte Lysate. Coupled in Vitro Transcription:Translation Procedure Using E. coli Extract. Hybrid-release translation hybrid arrest translation 免疫反应形成的沉淀素圈 antibody test This is end of chapter 8 * * * 转化率的影响因素 载体及DNA重组分子方面： 载体本身的性质：不同的载体转化同一株受体细胞，其转化率不同 载体的空间构象：质粒的超螺旋构象转化率最高，经酶切连接操作后的载体由于空间构象难以恢复，其转化率一般要比新制备的超螺旋质粒低两个数量级 插入片段的大小：对质粒载体而言，插入片段越大，转化效率越低 受体细胞方面： 受体细胞必须与载体相匹配，例如：pBR322转化大肠杆菌JM83株，转化率很低；但对大肠杆菌ED8767株的转化率则较高 转化方法方面： 受体细胞的预处理：影响最大 供受体的比例： Ca2+诱导转化 0.1 ml 感受态细胞 50 ng DNA 转化方法： Ca2+诱导转化 106 - 107 / mg DNA 原生质体转化 109 个原生质体 50 ng DNA 原生质体转化 105 - 106 / mg DNA l-DNA转染 107 - 108 / mg DNA 电穿孔转化 106 - 109 / mg DNA THIS IS END OF CHAPTER 7 第八章 重组子的筛选和鉴定 DNA分子的体外连接，从道理上讲是一种比较简单的过程。当载体分子经核酸内切限制酶切割之后，再同一组相应DNA限制片段群体退火，就将形成多种类型 的DNA分子。其中包括： 不带有任何外源DNA插入片段、仅是由线性载体自身再连接形成的环形DNA分子 由一个载体DNA分子和一个或数个外源DNA插入片段构成的重 组体DNA分子 单纯由数个外源DNA片段彼此连接形成的多聚DNA分子。不具各复制起点和复制基因，不能够在转化子细胞中稳定地 存留下来，而终将被淘汰掉成为无用的分子 面对由这种混合的DNA制剂转化而来的克隆群体，我们需要采用特殊的方法，才能： 筛选出可能含有目的基因的重组体克隆。 用某种方法检测从这些克隆中提取的质粒或噬菌体DNA，看它是否确实具有一段插入的外源DNA。 是否就一定编码有我们所研究的目的基因的序列。 由于重组率和转化率不可能达到理想极限，因此必须借助各种筛选和鉴定方法区分转化子与非转化子、重组子与非重组子、目的重组子与非目的重组子 　选择(S