ch7,8-受体细胞重组子的筛选.pptVIP

Cell free translation (1)兔子紅血球 紅血球為無核細胞，而能合成血紅素等蛋白質，兔子紅血球水解物(RRL, rabbit reticulocyte lysates)通常用在大分子轉譯上，能進行蛋白質水解、乙醯化、磷酸化等轉譯後修飾作用，將canine pancreatic microsomal membrane 加入RRL 中，能有用signalpeptidase 將signal peptide 切除，也能進行醣化作用。此一系統的缺點在於受到氧化態的thiols、雙股RNA、醣類的抑制，對鎂離子的耐受範圍窄等。已商品化的有Promega 的TNT?是一並行式的RRL 轉錄與轉譯反應系統；Ambion的PROTEINscript?II 是連鎖式的RRL 轉錄與轉譯反應系統，可產生50~200ng 的蛋白質；Novagen 的Single Tube protein System3(STP3) 是連鎖式的RRL 轉錄與轉譯反應系統，可產生biotinylated 蛋白質。 (2)小麥胚芽 小麥胚芽萃取物(WGE, wheat germ extract)含體外轉譯的重要組成，使用前須將內生性的氨基酸、mRNA、色素等去除，因缺RRL 系統中的球蛋白，所以用來合成小分子蛋白質，與RRL 系統相比，較不受到其他RNA 的抑制、比RRL 系統更需capped RNA、RRL 的轉譯後修飾作用較佳，商品化產品有Ambion 、Promega、Roche Molecular Biologicals。 (3)大腸菌 無論是原核或真核細胞的基因序列均可在此系統進行轉譯，但轉譯後修飾作用則缺乏， 商品化產品有Promega 的E. coli T7 S30 Extract System ； Ambion 的PROTEINscript?PRO，可轉譯60kDa 的蛋白質，產量可達100~1000ng；Novagen 的EcoPro?比傳統式的S30 Extract 的產量低。 體外轉譯系統的主要缺點是產量低，Roche Molecular Biologicals 所推出的RTS 500可大量表達蛋白質，此一儀器與專利的連續式無細胞系統結合，可在蛋白質合成時將抑制物去除，且加入合成所需基質，在每一反應中可得500 ug 蛋白質，分子量大於120kDa，此一系統特別適合在對細胞會有毒性的蛋白質表達。 Hybrid-release translation hybrid arrest translation 免疫反应形成的沉淀素圈 antibody test Western Blotting The term “blotting” refers to the transfer of biological samples from a gel to a membrane and their subsequent detection on the surface of the membrane. Western blotting (also called immunoblotting because an antibody is used to specifically detect its antigen) was introduced by Towbin, et al. in 1979 and is now a routine technique for protein analysis. The specificity of the antibody-antigen interaction enables a single protein to be identified in the midst of a complex protein mixture. Western blotting is commonly used to positively identify a specific protein in a complex mixture and to obtain qualitative and semiquantitative data about that protein. / This is end of chapter 8 * * * . Structure of digoxigenin- and biotin-modified nucleotides. Note that the digoxigenin and biotin groups in these examples are linked to the 5 carbon atom of the uridine of dUTP by