杨玲《细胞与遗传实验》实验二-2016-基础医学.pptVIP

细胞与遗传实验 杨 玲 细胞与遗传医学系 细胞实验二 5组细胞给予不同处理 正常、缺糖损伤、药物处理 现象的观察 （细胞存活情况的比较，形态学观察） 根据观察到的现象设计随后的实验 （机制相关的探讨） 实验内容 1.不同的实验分组相同 对照组（Control） ---正常培养的细胞 无糖损伤组（Glucose deprivation，GD） ---给予对数生长期细胞无糖培养约24小时 顺铂20umol/l处理组（DDP 20umol/l ） ---对数生长期细胞给予顺铂20umol/l处理24小时 顺铂40umol/l处理组（DDP 40umol/l ） ---对数生长期细胞给予顺铂40umol/l处理24小时 顺铂60umol/l处理组（DDP 60umol/l ） ---对数生长期细胞给予顺铂60umol/l处理24小时 实验内容 2.检测指标 细胞活力检测 cell viability assay WST-8 检测 噻唑蓝(四甲基偶氮唑盐，MTT) 可透过细胞膜进入胞内 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶，能使外源性MTT(淡黄色)还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan（甲臜）结晶，沉积在细胞中。其形成量与活性呈正相关。 该结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪，在波长492nm测定其光吸收值。可间接反映活细胞的数量变化。 introduction WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的formazan（高度水溶性） 。 电子转移 四脞盐 NADH NAD + WST?-8 WST ? -8 formazan CCK-8检测细胞活性原理 1-Methoxy PMS 1-Methoxy PMS, reduced 活细胞 细胞膜 培养基 colorless orange color Dehydrogenase WST-8： 2-（2-甲氧基-4-硝基苯基）-3-（4-硝基苯基）-5-（2,,4-二磺酸苯）-2H-四唑单钠盐 1-Methoxy PMS: 1-甲氧基-5-甲基吩嗪嗡硫酸二甲酯 生成的formazan的数量和活细胞的数量成正比。 细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞损伤越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。 器材与试剂 培养细胞(96孔细胞培养板) 酶标仪、移液枪、枪头等 试剂：CCK8检测试剂盒 　　　　DMEM培养液（高糖、无糖） 顺铂（DDP）5mg/ml Cell Counting Kit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂盒。 Cell viability assay 接种5×104/ml细胞于96孔板，每孔200ul培养液；分为五组，每组三个平行孔；37oC、5%CO2培养24h（对数生长期） ----此时属正常培养，高糖培养基（10%DMEM） 1、24h后，Control组继续用高糖培养基培养 2、24h后，无糖损伤组弃去培养液，随后加入无糖培养基培养（弃去或加入培养基时均应小心）继续培养 ------ GD组 3、24h后，DDP（顺铂）组弃去培养液，分别加入浓度为20umol/l，40umol/l，60umol/l的培养基 4、吸弃原培养液，加含CCK8试剂（10ul）的无血清DMEM培养 基110ul继续培养 5、1h后酶标仪450nm波长处测定吸光度 6、计算并分析结果（统计分析） 注意：吸弃的时候要小心 Cell viability assay (today) 要求 实验三 根据结果进行分析，希望思考进一步应进行的指标检测 阅读文献---选取感兴趣的细胞生物学方面的文章，权威杂志 NCS 翻译一篇文献，并于第6次实验课上课前交至学委处 原文长度不少于4页（不包括参考文献），近两年 阅读文献 then i will introduce the content of this experiment----the cell viability assay * then i will introduce the content of this experiment----the cell viabilit