基础生物化学实验课件植物叶片过氧化物同工酶的PAGE分析.pptVIP

2. 原理 2.3 聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 PAGE电泳根据其有无浓缩效应，分为连续系统与不连续系统2大类， 本次实验利用不连续系统. PAGE不连续电泳胶由浓缩胶和分离胶组成，具有较高的分辨率，是因为在电泳体系中集“样品浓缩效应、分子筛效应及电荷效应”为一体。 1 样品浓缩效应 (1)凝胶孔径不连续性 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性 (3)电位梯度的不连续性 (2)缓冲体系离子成分及pH值的不连续性: Tris:缓冲配对离子，维持溶液的电中性及pH值 Cl-:在电场中迁移率快，前导离子(leading ion) ，快离子。 Gly:其pI =6.0，在pH6.7的浓缩胶缓冲体系中，甘氨酸解离度很小，因而在电场中迁移很慢，称为尾随离子（trailing ion），慢离子。 当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加，其有效迁移率超过蛋白质;因此Cl-及NH2CH2COO-沿着离子界面继续前进。蛋白质分子由于分子量大，被留在后面,然后再分成多个区带. 大多数蛋白质在pH6.7或8.3时均带负电荷，在电场中，都向正极移动。 (3)电位梯度的不连续性 V(电泳速度)=E(电位梯度)8 * m(迁移率) E高m慢≈E低m快 由于蛋白质的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。 2 分子筛效应 分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。 分子量小且为球形的蛋白质分子所受阻力小，移动快，走在前面;反之，则阻力大，移动慢，走在后面。 分子筛效应不同于柱层析中的分子筛效应，后者是大分子先从凝胶颗粒间的缝隙流出，小分子后流出。 3 电荷效应 进入pH8.9的分离胶中，各种蛋白质所带净电荷不同，而有不同的迁移率。 表面电荷多，则迁移快；反之，则慢 各种蛋白质按电荷多少、分子量及形状，以一定顺序排成一个个条型的区带，从而达到分离的目的。 2.4 植物过氧化物酶同工酶的测定原理 (1)植物同工酶 凡能催化同一种化学反应，但其分子结构和带电性质不同的一组酶称同工酶。 植物组织中的同工酶（isoenzyme）是基因表达的产物。 每一种植物都有相同的遗传信息，其表达产物与植物的发育和所处的环境有十分密切的关系，植物不同组织和器官有不同的形态特征和化学组成，从而合成不同的酶蛋白。 在研究植物基因调控与生长发育、与环境条件的关系以及许多生理生化和遗传问题时，常常需要分析同工酶谱的差异。 (2) 过氧化物酶同工酶的测定 过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。植物体内许多生理代谢过程常与它的活性及其同工酶的种类有关。 利用过氧化物酶能催化H2O2把联苯胺氧化成蓝色或棕褐色产物的原理，将经过电泳后的凝胶置于有H2O2及联苯胺的溶液染色，出现蓝色或棕褐色产物的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶谱。 3. 试剂和样品 1 测试样品 新鲜植物叶片。 2 试剂 (1) 分离胶缓冲液: 3M Tris（HCl） pH8.8 (2) 分离胶贮液（30% Acr-0.8% Bis）：4℃贮存，一般可放置1个月左右。 (3)浓缩胶缓冲液: 0.5M Tris(HCl) pH6.7 (4)浓缩胶贮液（10% Acr-2.5% Bis）: 4℃贮存，一般可放置1个月左右。 (5) Tris-Gly电极缓冲液 pH8.3 注意：Acr和Bis是对中枢神经系统有毒的试剂，操作时应避免直接接触和吸入它的粉末。 (6)　 40% 蔗糖溶液(W/V)。 (7)　TEMED(浓度≥98%) (8)　 0.14% 过硫酸胺（AP）： 4℃贮存仅能用一周，最好当天配制。 (9) 0.1%溴酚蓝指示剂 联苯胺染色母液：联苯胺1g + 冰醋酸18ml + H2O 2ml溶解储于棕色瓶中。 注意：（1）联苯胺的毒性很强，其固体和蒸气都能通过皮肤迅速进　　　　　　　入体内，引起恶心、呕吐，损害肝和肾脏。联苯胺及它的盐都是致癌物质。 （2）联苯胺染色液要当天配制。 4. 操作方法 4.1 制胶架装配 4.2 分离胶制备 7.5％，配12ml，混合后的凝胶溶液，用枪加至两层玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约0.5cm，上覆盖 　 1－2mm高的蒸馏水或水饱和的异丁醇，用于隔绝空气，使胶面平整，静置30分钟-1小时使其聚合。 4.3 浓缩胶制备 4%，配4ml ，混合均匀后用枪将凝胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内(即分离胶上方)，插入加样梳，梳齿下不要有气泡存在，光下静置3