基础生物化学实验课件酸性磷酸酯酶动力学分析.pptVIP

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2018-04-05 发布于重庆
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基础生物化学实验课件酸性磷酸酯酶动力学分析.ppt

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基础生物化学实验课件酸性磷酸酯酶动力学分析

Kinetic Study of the Enzyme Acid Phosphatase (E.C. 3.1.3.2.) Basic Fetures of Enzyme High Catalytic Power: kcat /kun 107 High Specificity: reaction type and substrates Proteolytic Enzymes: peptide bonds Subtilisin: any kind of peptide bond Trypsin: X-K, X-R Thrombin: blood clotting R-G in specific peptide sequence Michaelis-Menten Model Michaelis Constant Initiational Velocity Lineweaver-Burk or double reciprocal plit Lineweaver-Burk or double reciprocal plot Reversible and Irreversible Inhibition Noncompetivitive Inhibition Reversible Inhibition Enzyme Acid Phosphatase (E.C. 3.1.3.2.) 1. 反应进程曲线 2.米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定 Lineweaver-Burk or double reciprocal plot 2.米氏常数（Km）和最大反应速度（Vm）的测定 1)酚标准曲线 Km和Vm的测定(做两组平行对照) Km、Vm测定时间设计 3. NaF及KH2PO4抑制类型(可逆或不可逆)的判断---V-[E]曲线的制作 NaF和KH2PO4可逆抑制类型（竞争性、非竞争性或反竞争性）的判断实验中应注意的问题：实验中应注意的问题 35度精确反应15分钟, 各管先后加入2毫升1M碳酸钠溶液和0.5毫升福林-酚稀溶液, 35度保温10分钟显色,测A680 A680 各管加0.5毫升福林-酚稀溶液, 35度保温10分钟显色,测A680 分别在35度反应10分钟，各管先后加入2毫升1M碳酸钠溶液终止反应 0.4 0.4 酶（ml) 0.5 0.2 0.3 0.4 0.44 0.1 0.3 0.2 0.3 0.4 0.44 0.1 0.3 0.3 0.4 0.5 0.54 0.2 0.4 Buffer (ml) 0.1 NaF 0.1 KH2PO4 0.1 (5mM 0.3 (5mM 0.2 (5mM 0.1 (5mM 0.06 (5mM 0.4 (0.5mM 0.2 (0.5mM 0.3 (5mM 0.2 (5mM 0.1 (5mM 0.06 (5mM 0.4 (0.5mM 0.2 (0.5mM 0.3(5mM 0.2 (5mM 0.1 (5mM 0.06 (5mM 0.4 (0.5mM 0.2 (0.5mM) S体积（mll） 1/s 1.5 1 0.5 0.3 0.2 0.1 1.5 1 0.5 0.3 0.2 0.1 1.5 1 0.5 0.3 0.2 0.1 （S）mM 0 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 管号 NaF KH2PO4 组别 * * What does Km reveal? What is Steady State? Why do initiational velocity curve? Why do phenol Standard Curve? Steady State Km: equals [S] at witch V0 = 1/2 Vmax If k2 k-1, Km = the dissociate constant of the ES Vmax =kcat[E]t =k2[E]t Competitive Inhibition Reversible Inhibition Anti-compititive Inhibition Catalyze following reaction: The Product Phenol Can be Detected by Folin-Phenol Reagent Sodium Carbonate Is Used to Stop the Enzyme reaction Experimental