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线粒体病及其分子诊断 福建医科大学附属第一医院检验科 福建医科大学医学检验系 福建医科大学基因诊断研究室 1962年Luft等首先报道了一例女性患者，其主要表现为肌无力、极度不能耐受疲劳、多汗，甲状腺功能正常。 经生化证实为线粒体氧化磷酸化脱偶联引起，并被确定为线粒体肌病。从此，线粒体异常引起的一类疾病被确定为一组独立的疾病实体－－线粒体病。 一.什么是线粒体病 线粒体病（mitochondrial disease） 又称：线粒体细胞病 病因：线粒体（mitochondrial, mt）功能异常 （包括线粒体基因组、核基因组的遗传缺陷以及二者之间的通讯缺陷） 发生率约为11.5/10万（约每8500人中有1人）。 二.线粒体、线粒体DNA的结构及特点 线粒体是细胞的能量工厂， 约90％的细胞ATP来源于 线粒体的氧化磷酸化。 不同组织细胞所 含的线粒体的数量不同，在能量需求高的组织，如脑、骨骼肌、心脏和肾脏等的细胞内有成千上万个线粒体；而在能量需求较低的细胞内仅有10～100个线粒体。 线粒体DNA 半自主复制的细胞器，有独立的遗传装置。 2～10个拷贝线粒体DNA（mitochondrial DNA, mtDNA）/线粒体。 mtDNA约占细胞总DNA的1％，环状，轻重两条链互补。 含16569个碱基，编码2个rRNA， 22个tRNA和13个氧化磷酸化过 程所需要的蛋白多肽。 线粒体基因组各基因之间 无内含子，呈紧密排列。 线粒体DNA的特点 非孟德尔的母系遗传 mtDNA为母系遗传，发生在生殖细胞系中的突变能通过女儿传递给子代，引起母系家族性疾病； 异质性与阈值效应 线粒体几乎存在于人体的所有细胞中，有害的突变基因常常仅影响部分mtDNA，这就使细胞、组织中同时存在野生型DNA和突变型DNA。当mtDNA突变数目达到某一数量时，可引起某组织或器官的功能异常而出现临床症状，这就是阈值效应。 线粒体的突变分为四类 mtDNA编码蛋白基因的点突变 mtDNA编码tRNA基因的点突变 mtDNA的大片段重组包括片段缺失和重复 mtDNA数量的减少。 确定mtDNA突变是否致病的标准 种系发育中高度保守的序列或突变的碱基有明显的功能重要性 异质性的存在，即野生型和突变型mtDNA共存于一个细胞内 在大量的正常人群中未能发现 在有类似表现型却又不属于同一家系的患者中发现相同的突变 异质性的程度和临床生化缺陷严重程度正相关 使用无线粒体的ρ0细胞系的细胞融合实验证实，该突变可引起呼吸链缺损。 线粒体与细胞凋亡有关 细胞凋亡在线粒体病的发生中起重要作用。 当细胞受损伤或在应急情况下，可诱导procaspases聚集活化，其中一条信号传递通路是由线粒体释放细胞色素c开始的。 释放到胞质的细胞色素c可与链接蛋白Apaf-1结合，从而启动和放大Caspase激活过程，进而启动细胞凋亡。 四.原发性线粒体病的临床分类 目前已经报道了50多种线粒体基因的点突变与疾病有关，这些疾病包括肌病、心肌病、痴呆、肌阵挛、耳聋、失眠、贫血、糖尿病和脑中风等。 实验室检查 乳酸和丙酮酸盐：空腹血乳酸盐浓度≥3mmol/L和空腹脑脊液乳酸盐浓度＞1.5mmol/L支持线粒体病的诊断，但需排除其他导致乳酸盐增高的原因。 血浆磷酸肌酸激酶（CK）：明显增高可能见于线粒体DNA耗竭。 此外，实验室检查应注意结合影像学、神经生理学、心电图和病理活检等检查。 分子诊断 线粒体病的分子诊断 1. Southern杂交 mtDNA大片段重组的基本诊断方法。通常情况下杂交片上只能得到一条大小为16.6Kb的条带，当有缺失存在时，除了16.6Kb的条带外，还有一条分子量较小的条带；而当有重复存在时，则还有分子量较大的条带； 在有缺失的病人中，不同组织间野生型和突变型的mtDNA的比例相差悬殊，肌肉、脑、肝、肾所含的突变mtDNA比例较高，这些组织可用Southern杂交检测到缺失； 而外周血中缺失型mtDNA的比例很少，极少报道用Southern杂交检测到外周血中mtDNA的缺失。 RT-ARMS-qPCR系统 ARMS（amplified refractory mutation system）系统，又称扩增阻滞的突变检测系统，能够检测已知位点的突变，real-time PCR能够进行定量检测，二者相结合成的RT-ARMS-qPCR系统能够对已知位点的突变进行定量检测。 由于线粒体DNA遗传病的阈效应的特点，近年来有人建立了突变型DNA的RT-ARMS-qPCR定量检测方法，主要是对突变型线粒体DNA进行定量检测，该系统能够很好地探知引发某一线粒体病的突变型DNA的阈值，对于彻底阐明突变型mtDNA在线粒体病的发