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第六章 酶分子修饰 一、酶分子修饰的原因 酶在生物技术中占有核心地位 酶具有反应专一性、催化效率高及反应条件温和等优点，在工业、农业、医药等方面得到越来越多的应用。 大规模应用的酶及酶工艺尚不够多，导致这种现象的原因是多方面的，这主要表现在： (1) 稳定性 酶是生物活性大分子。一旦离开生物细胞，离开其本身特定的作用环境，在发酵分离提纯、反应、制剂及固定化等过程中，常常显得不够稳定，不能适应大量生产条件的需要。 （2）作用的最适条件 （pH中性、室温，溶液状态） 一般酶反应是在基本接近中性，与室温相距不大的水溶液中进行的。 在工业应用上，由于产物、底物带来的影响，作用时的pH常常不在中性范围内。 温度升高，酶促反应速度加快，但酶往往不稳定，如果降低温度，又影响反应速度。 底物不溶于水时，酶就更难发挥作用。 （3）酶的主要动力学性质的不适应 （Km值大，与底物的亲和力小） 米氏常数Km值过大，使反应在低底物浓度下不能高速进行，由于体内各种代谢物质的浓度较低，对Km较大的酶用于临床检测或治疗时，影响就更大。 （4）临床应用的特殊要求 绝大多数酶来自动、植物及微生物，对人体来说这些酶都是外源蛋白质，具有抗原性，都有可能引起人体的过敏反应。 酶进入人体后也常会由于一些蛋白酶、抑制剂或抗体的作用而失去其活力，特别是当酶进入体内以后不能迅速到达或集中于病灶时，这种情况尤为明显。 （一） 如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性? （二）如何保护酶活性部位与抗抑制剂? （三）如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水 解酶? （四）如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境? 二、酶的分子工程 （一）基本内容 1、酶分子改造： 对酶蛋白的主链“切割”，即根据酶的结构与功能的研究，通过一种相应的方法，去掉酶分子那些与活性无关而有碍应用的部分，提高其活性，增加稳定性。 2、酶分子模拟： 根据酶作用原理的研究，模拟酶的活性中心和催化机制，用化学合成的方法制备高效、专一、分子较简单、较稳定的新型催化剂。（模拟酶） 3、酶的化学修饰： 即在体外将酶的侧链基团通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶的酶学性质的技术。 （二）酶的分子工程分类 1、分子生物学水平 利用工程方法对DNA或RNA进行分子改造，以期获得化学结构（一级结构和空间结构）更为合理的酶蛋白。 2、蛋白质水平 通过分子修饰的方法来改变已分离出来的天然酶的结构。人们用化学法或酶法对酶的一级结构进行改造。 包括酶的一级结构中氨基酸的置换，包括用酶将肽链切断或部分切除，使酶的空间构象更为稳定。 另一方面是对酶分子中氨基酸残基的修饰，即酶的化学修饰。 （三）酶的化学修饰 蛋白质的化学修饰：通过化学基团的引入或除去，而使蛋白质共价结构发生改变。 酶的化学修饰：利用修饰剂所具有的各类化学基团的特性，直接或经一定的活化步骤后与酶分子上的某种氨基酸残基（一般尽可能选用非酶活必需基团）产生化学反应，从而改造酶分子的结构与功能。 酶化学修饰的方法 （一）金属离子置换修饰 （二）大分子结合修饰 （三）酶分子的侧链基团修饰 （四）肽链有限水解修饰 （五）氨基酸的置换修饰 （六）核苷酸链剪切修饰 （七）物理修饰 第一节 金属离子置换修饰 一、 概念 通过改变酶分子中所含的金属离子，使酶的特性和功能发生改变的方法。 二、作用范围 含有金属离子的酶 金属酶特点：金属离子往往是酶活性中心的组成部分，对酶的活性起重要作用。 （ 1 ）若除去酶活性中心的金属离子，酶会失活，重新加入原离子则酶复活。 （ 2 ）加入不同的金属离子（即金属离子置换）则可使酶呈现不同特性。 三、步骤 1）酶分离纯化 2）除去原有的金属离子： 酶液中加入一定量金属螯合物，使酶分子中的金属离子与EDTA形成螯合物，此时酶成为无活性状态。通过透析或超滤、分子筛层析等方法，可将EDTA-金属螯合物从酶液中分离除去。 3）加入置换离子： 用不同的金属离子加到酶液中，酶蛋白与金属离子结合。 作用： 1、阐明金属离子对酶作用的影响 2、提高酶活力 如:将其它杂离子型的α-淀粉酶都换成钙离子型,会提高酶活力与稳定性;结晶钙型α-淀粉酶活力比一般结晶杂离子型α-淀粉酶活力提高3倍以上，稳定性也大增。 蛋白酶(锌型，Zn2+): 用Ca2+置换Zn2+成钙型蛋白酶，钙型蛋白酶活性提高20~30%。 3、增强酶的稳定性 如: Fe-SOD→M