生化设计实验 蚕豆病.pptVIP

蚕豆病简介 蚕豆病是一种6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G-6-PD）缺乏所导致的疾病，表现为在遗传性葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷的情况下，食用新鲜蚕豆后突然发生的急性血管内溶血。 实验原理 一、高铁血红蛋白还原试验  红细胞膜的破坏 还原型谷胱甘肽 体内重要的抗氧化剂 保护红细胞膜蛋白的完整性 我组讨论认为：要想探讨该病发生的分子基础 ，需要对目的基因进行基因结构分析，即DNA序列检测 五、患者体型瘦小与该病症是否有关，为什么？（选答） 患者体型瘦小与该病症有关 DNA序列测定方法 直接法 间接法：对于未知片段，或片段过长，用几种方法（RFLP；PCR-RFLP；SSCP）来粗略的估计待分析基因的一级结构是否与对照基因相同 双脱氧末端终止法（Sanger法） 化学裂解法（Maxam-Gilbert法） DNA的自动化测序 DNA序列测定方法 DNA链的方向是5? → 3? 交替的磷酸基团和戊糖构成了DNA的骨架 (backbone)。 * * * 2011级临床四大班 第四实验室1,2小组 组员：杨从德（201101171） 王永波（201101168） 武桂芬（201101170） 王小花（201101167） 试验时间:第十八周 (yangcongde@yahoo.cn) 一、根据上述患儿的临床表现和实验室检查，初步判断患儿是何种疾病？ 蚕豆病 恶心、呕吐、面色苍白 皮肤及巩膜黄染 红细胞 1.98×1012/L 血红蛋白53g/L 血清总胆红素85.5μmol/L 尿蛋白（++） 尿胆红素(－) 尿胆素原(+) 尿液镜下未见红细胞 黄疸 红细胞膜不完整，已破裂 红细胞含量少 含量明显增加 血红蛋白量减少 排尿呈酱油样色 游离胆红素增加 溶血性黄疸 蚕豆病 肠肝循环增多 易发人群 多见于儿童，男性患者约占90%以上。 2、设计实验进一步明确诊断。 贫血、黄疸 有和无遗传史 无或有诱因（食用 蚕豆、服用药物、 感染） 体征：脾肿大、黄疸 血常规检查 血清学检查 检查HA的病因 G6PD筛选试验 G6PD确诊试验 Hb↓、网织红细胞↑ 间接胆红素↑尿胆原↑游离Hb↑ 结合珠蛋白↓ 怀疑其他HA,相应病因检测结果正常 G6PD荧光斑点试验 红细胞G6PD活性测定 G6PD基因分析 其他筛选试验 高铁血红蛋白还原试验 初诊或确诊 G6PD缺陷症 确诊溶贫（血管 内溶血） 确诊G6PD 做1项或2项 做1项 高铁血红蛋白还原试验 G6PD荧光斑点试验 红细胞G6PD活性测定 筛选试验 →确诊试验 实验原理：在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中，高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降（分光光度技术） 亚铁血红蛋白 高铁血红蛋白 高铁血红蛋白还原酶 NADPH(辅酶) 亚甲蓝(递氢体) 实验反应方向 主要试剂：0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液①、 0.4mmol/L亚甲蓝溶液 ②、0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液③、混合液 （等量①+②+③）、生理盐水、抗凝剂 仪器：紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支 高铁血红单白还原实验 实验流程 取静脉血1. 8mL 于抗凝管，混匀 抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg) 离心沉淀 1000 r/ min 15 min 调整 血细胞∶血浆=1∶1 ，混匀 → 调整后全血（备用） 1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠 1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 混匀 → 混合试剂（备用） 1ml 0.14 mmol/ L 亚甲基蓝液 高铁血红单白还原实验 实验流程 取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入试剂 　高铁血红蛋白还原试验操作步骤 混合试剂/ mL 0. 01 / / 生理盐水/ mL / 0. 01 / 0. 18 mol/ L