口蹄疫诊断技术规程.docVIP

口蹄疫诊断技术规程（NY／SY150-2000 ) 1．范围 本规程规定了口蹄疫正向间接血凝试验、屠宰品中口蹄疫病毒检测试验及口蹄疫病毒RT - PCR检测试验。正向间接血凝试验适用于口蹄疫疫苗接种血清抗体水平监测、流行病学调查和进出口动物检疫；口蹄疫病毒检测试验和RT - PCR检测试验适用于猪的屠宰品中的口蹄疫病毒检测。 2．正向间接血凝试验 2.1试剂 2.1.1纯化灭活口蹄疫病毒致敏醛化蹂酸化绵羊红细胞，标准阳性、阴性血清，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产。 2.1.2稀释液，配制方法见附录A。 2．2操作方法 2.2.1待检血清的灭活 将待检血清放人56水浴中灭活30分钟。 2.2.2待检血清的稀释 用稀释液将待检血清稀释成1：4，1：8，1：16，1：32，1：64，1：128， 1：256，1：512等8个稀释度。 2.2.3阴、阳性血清的稀释 用稀释液将阴性对照血清稀释成1:16，将阳性对照血清稀释成1：5120 2.2.4加样 在干净的V型96孔110°血凝板的第1～8孔加各稀释度待检血清50μ1，第10孔加1：16的阴性对照血清50μ1，第11孔加口蹄疫O型阳性对照血清（1:512) 50μ1；第12孔加稀释液50μ1（空白对照孔）。 ?第1～8孔和10～12孔加口蹄疫诊断液，每孔25μl。 如用液体诊断液，只需摇匀便可加样。若用冻干诊断液，则需提前7～10天加人稀释液（每瓶5m1 )浸泡（在4～6下），方可使用。 2.2.5振荡混匀 加样完毕后，立即将血凝板置于微量振荡器上，振荡1分钟，取下放在白纸上，观察血球应均匀悬浮，不得沉淀，否则应继续振荡。 2.2.6静置 振荡混匀后，取下血凝板并盖上大小适中的玻璃板，防止水分蒸发，室温下静置1.5～2小时，或次日判定结果。 2.3结果判定 2.3.1先观察对照孔，第10孔（阴性血清对照孔）、第12孔（稀释液对照孔）应无凝集现象，呈小圆点状（一）。 2.3.2第11孔（阳性血清对照孔）应有50％以上的血球产生凝集，即（＋＋）（阳性反应）。 2.3.3在对照孔合格的情况下，观察的第1～8孔，以红血球呈“＋＋”凝集的待检血清的最大稀释度为其抗体效价。例如，第1排的第3孔出现“＋＋＋＋”凝集（90～100％红血球发生凝集），第4孔呈“＋＋＋”凝集（75％凝集），第5孔呈“＋十”凝集，第6孔呈“＋”凝集，则判定该份血清中的口蹄疫抗体效价为1：64（第5孔）。 2.4抗体效价与抗感染的关系：口蹄疫O型抗体1：128以上为免疫合格。 3．屠宰品中口蹄疫病毒检测 3.1材料准备 3.1.1器材：高速冷冻离心机、普通离心机、组织匀浆器、旋涡振荡器、V型(1350) 96孔微量反应板、微量振荡器、盐水接头、8号注射针头（磨成平口）、橡胶乳头。 3.1.2健康成年家免血清：62水浴30分钟灭能，冻结保存。 3.1.3口蹄疫A，O，C，Asia－I四型的红细胞诊断液及标准抗原，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产，按说明书使用。 3.1.4被检材料的采取、输送和保存：在肉联厂、屠宰场等地采取材料，以采取淋巴结和脊髓为主。每种样品3～5克，装入小瓶置冰瓶中送往试验室。试验室收到材料后，立即向小瓶内装入被检材料4～5倍量的50％甘油、pH7. 6的0 . 05mo1/L磷酸一缓冲液（配制法见附录B）置－2 0保存，并详细记载材料名称、来源、采集时间、地点及保存条件。 3.1.5试验用乳鼠：每个样品应准备一窝10只2～3日龄吮乳小白鼠并带母鼠。 3.2操作方法 3.2.1被检材料的处理： 3.2.1.1取1克左右的淋巴结和脊髓等，分别用pH7. 6 ，0.05mol/L的磷酸缓冲液洗二次，用灭菌滤纸吸干，剥去被膜，称取0.5克。每20份样品随机混合为一份混合样品，加少许石英砂研细，加pH7.6, 0.05mol/L磷酸缓冲液89ml，制成1：10悬液，再加人10000单位／毫升的青霉素、链霉素1毫升，置4冰箱过夜。 3.2.1.2三氯三氟乙烷（F－113)处理：将3.2.1.1中制备的悬液，以8000r/min 4离心30分钟。取上清液置组织匀浆器的搅拌缸中，加人20% (V/V）低温预冷F- 113，以10000～12000r/min搅拌15分钟，将溶液移人离心管，8000r/min 4离心20分钟，吸取水相于三角瓶中，并量体积。 3.2.1.3聚乙二醇（PEG）浓缩：按3.2.1.2中制备的溶液容积加人10% (V/V）的PEG (M·W·6000）溶解，置46小时或过夜。或加入等体积的饱和硫酸铰（饱和度50%pH7.6，配制方法见附录C) 4过夜。而后8000r/min4离心30分钟，去上清，沉淀用pH7. 6 , 0.05mol几的磷酸缓冲液悬浮至4ml，4过夜，再以8000r/mi