口蹄疫亚洲I型抗体液相阻断ELISA作业指导书.docVIP

作业指导书 第二章 第1页 共3页 口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA 作业指导书 SQSYK-ZYB-004-1.0 第一版 第0次修改 起草人： 2011年04月 日颁布、实施 1．适用范围 试剂盒来自中国农业科学院兰州兽医研究所，适用于亚洲I型口蹄疫抗体检测。 2. 器材准备 2.1移液器：5-50ul移液器、0.2-10ul移液器、50-200ul移液器、50-300ul移液器各一把。 2.2移液枪头。 2.3抗原抗体反应板：微量血凝板（U型、V型均可）5块，试剂盒配备两块，用于被检血清的稀释和抗原抗体反应。 2.4超纯水，无离子水或蒸馏水。 3. 试剂准备 3.1 包被缓冲液（PH9.6） 将试剂盒配备的碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开，将胶囊内粉末小心倒入100ml无离子水中溶解即可。4℃存放，1月内有效。 3.2 洗涤液（PBST） 将本试剂盒配备的25倍浓缩PBST液（可能有结晶形成，用时微热溶化）用无离子水或蒸馏水做1:25稀释。（如果PH降低，务必用NaOH调制7.4） 3.3 底物溶液 取1片柠檬酸-磷酸盐片剂（试剂盒配备）溶于100ml无离子水中，溶解后，取50ml溶液，再加1片邻苯二胺（OPD）片剂，充分溶解，分装（5ml\瓶或10ml\瓶），避光-20℃保存。用前避光溶化，临用时每1ml上述溶液加10ul3%的双氧水（H2O2）。务必加双氧水！ 4. 操作步骤 4.1 用包被缓冲液稀释亚洲I型口蹄疫病毒兔抗血清至工作浓度（1:1000）,在ELISA板上每孔加50ul，振荡，封板或置湿盒内，室温过夜。 4.2 抗原抗体（阴阳性对照血清及待检血清）反应根据不同的需要，选择图1-2中的一种布局在抗原抗体反应板上操作。 图1 96孔酶标板检测10份样品布局图 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H S11：8 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32 —1:4 1:16 1:64 1:8 1:32 1:128 1:64 1:256 1:128 1:512 病毒抗原对照 1:256 1:1024 1:512 1:2048 1:1024 1:4096 图1为抗体滴度测定（定量）检测10份样品布局图；图2为抗体滴度测定（定量）检测20份样品布局图。 作业指导书 第二章 第2页 共3页 口蹄疫A型抗体液相阻断ELISA 作业指导书 SQSYK-ZYB-004-1.0 第一版 第0次修改 起草人： 2011年04月 日颁布、实施 图2 96孔酶标板检测20份样品布局图 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A B C D E F G H S11：32 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 +1:32 —1:4 1:64 1:64 1:8 1:128 1:128 1:256 1:256 S111:32 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S20 1:512 病毒抗原对照 1:64 1:1024 1:128 1:2048 1:256 1:4096 以图1为例，在U型血凝板上按50ul\孔量用PBST将待检血清从1:4开始做2倍连续稀释至1:512。同时，按图示稀释阴阳性对照血清，然后每孔加入50ul用PBST稀释到使用浓度的亚洲I型口蹄疫病毒抗原（1:8，即1份病毒抗原加7份PBST），病毒抗原对照孔加100ul。振荡混匀，封板，4℃过夜。加入病毒抗原后血清的稀释度变为从1:8开始的2倍稀释。 4.3用洗涤液（1×PBST）连续洗ELISA板5次，在吸水纸上甩干，再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至ELISA板上的相对应孔，每孔50ul，封板，37℃温育1小时。 4.4同上洗版5次，甩干。用豚鼠兔抗血清稀释液稀释亚洲I型口蹄疫病毒豚鼠抗血清至工作浓度（1:1000），每孔加50ul，封板，37℃温育1小时。 4.5同上洗版5次，甩干。用1×PBS