第一章节提取与沉淀分离技术幻灯片.pptVIP

* 1.5ml? 对数生长期细菌 100μl NaCL(5M)?， 混匀 30μl 10%SDS,3μL蛋白酶Ｋ，混匀 沉淀，溶于500μl? TE缓冲液中，混匀 (37℃,1小时 ) (5000rpm,1min离心) 80μl的CTAB/NaCL,混匀；65℃ 10min（可不做） 第四节 核酸的提取与沉淀分离 操作： * 加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液 取上清，以下操作与技术1中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致 (混匀) (离心12000rpm,4-5min) 上清 第四节 核酸的提取与沉淀分离 * 第四节 核酸的提取与沉淀分离 技术3：酵母菌基因组RNA的提取 仪器： 同技术1； 试剂： SE缓冲液（1M山梨醇，0.1M EDTA pH7.5 ）；溶菌酶（50mg/ml）；20％PVP；蛋白酶K缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5% SDS 1mM EDTA）；其余同前 * 1.5ml? 对数生长期细菌 溶于590ulSE缓冲液中混匀 (12000rpm,8-10min离心) (12000rpm,1-2min离心) 加入1.2ml的CTAB/NaCL,200μl20%PVP 混匀 (加入10ul溶菌酶37℃,1小时) 溶于100ulNaCL中混匀 (加入0.5μl蛋白酶Ｋ， 37℃,1小时) 第四节 核酸的提取与沉淀分离 操作： * 等体积酚/氯仿/异戊醇混合液,混匀 (65℃ 30min) (12000rpm,4-5min离心) 上清,以下操作与技术1中有机溶剂抽提、沉淀、干燥、除RNA 、复溶等步骤一致。 第四节 核酸的提取与沉淀分离 * 为了保证核酸结构与功能的研究，完整的一级结构是最基本的要求，因为遗传信息全部贮存在一级结构之中，核酸的一级结构还决定其高级结构的形式以及和其它生物大分子结合的方式。对于核酸的纯化应达到以下三点要求： 1．核酸样品中不存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子； 2．其它生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度； 3．排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子时应去除RNA，反之亦然。 第四节 核酸的提取与沉淀分离 * 第三节 沉淀分离 所以对某一蛋白质来说，在温度和pH值等盐析条件确定(即β确定)，所采用的盐确定(即Ks确定)以后，蛋白质的溶解度决定于离子强度I, 可用下式计算： I = 1/2 ∑miZi2 mi:溶液中离子的摩尔浓度 Zi：离子的价数 对于多种蛋白质或酶的混合液，可采用分段盐析法进行分离纯化。 盐析沉淀法 * 第三节 沉淀分离 2.盐的选择： 蛋白质的盐析通常采用中性盐，如硫酸铵、硫酸钠、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等，其中应用最广的是硫酸铵。 硫酸铵是一中性盐，对蛋白质有相当好的安定作用。又因为其离子容积较大，吸走水分子的能力也大，成为有效的盐析工具。 硫酸铵在水中的溶解度大而温度的影响小( 25℃时溶解度为4.1mo l/L，即767g/L;0℃时溶解度为3.7mol/L，即697g/L)，而且价廉易得，不易引起蛋白质变性，分离效果比其他盐好。 但是，用硫酸铵盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子会干扰蛋白氮的测定，故有时也要用其他盐来进行盐析。磷酸钾和硫酸钠的盐析系数Ks较大，但由于在较低温度下的溶解度太低,受温度影响大，故应用不广泛。 盐析沉淀法 * 第三节 沉淀分离 3.硫酸铵浓度的计算与调整方法 : 通常硫酸铵的添加以百分饱和度来表示 (不是浓度百分比)，例如大部分蛋白质可在 80% 硫酸铵饱和度下沉淀。因为硫酸铵加入的体积很大，会改变最后的总体积，很难由浓度百分比来计算， 因此使用百分饱和度作为沉淀蛋白质的度量。 盐析沉淀法 用硫酸铵进行盐析时，蛋白质溶液中硫酸铵浓度的调整方法主要有二种 ： 1）、加入饱和溶液法 要求：蛋白质溶液体积不大，所需调整的硫酸铵浓度不高 V= V0(S2-S1)/（1-S2） V:所需加进的饱和硫酸铵溶液的体积；V0:原溶液体积；S2：所需达到的硫酸铵饱和度；S1:原溶液的硫酸铵饱和度。 饱和硫酸铵的配制方法：在一定量的水中加入过量的硫酸铵，加热至50－60℃，趁热滤去沉淀，再在0℃或室温平衡1－2天，有固体析出时达100％饱和度。 * * 第三节 沉淀分离 2）、加入固体盐法 要求：饱和度高，不增大溶液体积 t=G(S2-S1)/（1-AS2） S2，S1:分别代表所需达到的硫酸铵饱和度和原溶液的硫酸铵饱和度；t：将1L S1饱和度的溶液提高到