第21章常用分子生物学技术的原理及应用.pptVIP

第二十一章 常用分子生物学技术 原理及其应用 第 1 节分子印迹与杂交技术 蛋白质的转移只有靠电转移 蛋白质的检测以抗体作探针 用碱性磷酸酶（ALP）、辣根过氧化酶（HRP）标记第二抗体，底物显色来检测蛋白区带的信号，底物亦可与化学发光剂结合以提高敏感度。 或用同位素标记第二抗体，放射自显影法检测蛋白区带的信号。 第 2 节 PCR技术的原理与应用 四、几种重要的PCR衍生技术 （一）反转录PCR技术 (RT-PCR) （二）原位PCR技术 (ISP) （三）实时PCR技术 (real time PCR) 第 4 节基因修饰动物模型的建立及应用 核转移技术 （nuclear transfer） 即动物整体克隆技术，将动物体细胞核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，使之发育成个体，即个体克隆(clone)。 如克隆羊多利 PCR反应循环 变性 95?C左右 延伸 适温 (72?C左右) 退火 Tm-5?C (55?C左右) 经过30个左右的循环后，PCR的扩增倍数为(1+x)n, x=75%, n为循环数. 二、PCR技术的主要特点 1.特异性强 2.灵敏度高 3.简便快速 4.对标本的纯度要求低 2. 利用特异性引物以cDNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段。 3. 利用简并引物从cDNA文库或基因组文库中获得具有一定同源性的基因片段。 4. 利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中随机克隆基因。 1. 与反转录反应相结合，直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。 三、PCR技术的主要用途 （一）目的基因的扩增与克隆 （二）基因的体外定点突变 （三）基因突变分析 （四） DNA和RNA的微量分析 （五） DNA序列测定 反转录PCR法： 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction，PCR) 加热变性 加入特异性引物 DNA聚合酶 重复上述步骤 扩增出大量的产物 方案： AAnA TTnT 5′ 5′ mRNA 反转录酶 mRNA cDNA 3′ TTnT AAnA 3′ 5′ 3′ 5′ 实时PCR技术原理 第3节 基因文库 Gene Library 基因组DNA文库 (Genomic DNA library) cDNA文库 (cDNA library) 基因文库 (gene library) 是指一个包含了某一生物体全部DNA序列的克隆群体 一、基因组DNA文库 基因组DNA文库（Genomic DNA library)是指包含某一生物体全部基因组DNA序列的克隆群体，其储存着一个细胞或生物体的全部基因组DNA的编码区和非编码区的DNA片段，含有基因组的全部遗传信息。 二、 cDNA文库 cDNA文库是指某一组织在一定条件下所表达的全部mRNA经反转录而合成的全部cDNA的克隆群体，它将细胞的基因表达信息以cDNA的形式储存于的受体菌中。 基因组DNA文库 cDNA文库 是指将外源基因整合到动物细胞或植物细胞的基因组中并使外源基因在动物细胞或植物细胞中稳定遗传和表达的技术。 基因的导入方式主要： 显微注射法 胚胎干细胞法 逆转录病毒感染法 一、转基因技术 转基因技术 基本原理是采用基因转移技术使目的基因整合入受精卵的细胞核内或着床前的胚胎干细胞，然后将细胞导入受体动物子宫，使之发育成个体。 转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal) ——目的基因的受体动物 二、核转移技术 基因剔除技术（gene knock-out） 也称基因靶向(gene targeting)灭活，有目的去除动物体内某种基因的技术。 三、基因剔除技术 基本原理：同源重组 基因剔除细胞系、基因剔除小鼠 四、基因转移和基因剔除的应用 建立疾病动物模型 已建立：地贫、动脉硬化、帕金森病等 生物制药 治疗性克隆和生产用于人体器官移植的动物器官 国家“973”组织工程学首席科学家曹谊林教授1998年曾在老鼠背上培育出人耳朵 第 5 节??? 生 物 芯 片 技 术 DNA芯片(DNA chip)、DNA阵列(DNA array) cDNA芯片(cDNA chip) 一、基因芯片(gene chip) 指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。 使探针与荧光标记的待测样品分子进行杂交，通过检测系统检测杂交的