减毒素沙门氏菌介导的禽呼肠孤病毒σC基因疫苗的构建及其免疫特性初步研究.pdfVIP

禽类传染病一其他 减毒素沙门氏菌介导的禽呼肠孤病毒6C基因疫苗的构建及其免 疫特性初步研究 王存伟3曹三杰黄小波万俊杰丈心田 (四川农业大学动物医学院动物传染病与基因芯片实验室，四川省动物疫病与人类健康重点实验室， 四川雅安625014) 摘 要 核表达质粒在cos．7细胞中可进行表达。试验将pvAx．芘真核表达质粒电转入减毒沙门氏菌，成功构建了介导禽呼肠 sll33 株攻毒实验，结果表明实验疫苗组对雏鸡的保护率为66．7％。 关麓词 禽呼肠孤病毒；oc基因；减毒沙门氏菌；基因疫苗 鸡病毒性关节炎又名病毒性腱鞘炎，是由呼肠孤病毒引起的肉用型、肉蛋兼用型鸡的一种传染 病Ill。临床上主要症状是胫和跗关节上方腱索肿大，趾屈腱鞘和伸腱鞘肿胀。病鸡跛行、蹲坐、不 愿走动，严重者腓肠肌腱破裂。由于病鸡运动障碍，生长停滞、消瘦、饲料利用效率低导致屠宰率 下降、淘汰率增高，给养鸡业造成很大的经济损失。 目前，对该病的防治主要用火活苗和弱毒苗，取得了一定的效果。灭活苗虽然但灭活苗免疫使 用剂量大，但需要配合佐剂，对机体刺激大，需要多次免疫才能产生较好的免疫效果；弱毒苗可以 刺激机体产生坚强有效的免疫力，但制作繁琐，存在多次接种使其毒力恢复或增强等问题。因此， 研制一种安全、有效的疫苗来更好地防治鸡病毒性关节炎必然成为ARv疫苗研究的趋势。 利用减毒沙门氏菌携带DNA疫苗，能持续刺激机体产生细胞免疫、体液免疫和黏膜免疫应答， 并可获得对载体菌的免疫，有良好的应用前景【2l。为探讨减毒沙门氏菌作为ARvDNA疫苗载体的可 能性，本研究构建了携带ARVoC基因的DNA疫苗的重组减毒沙门氏菌，对其安全性、免疫原性进行 了研究。 1实验材料与方法 1．1材料 1．1．1主要试剂 减毒沙门氏菌SL7207由德国Heln山oltz感染研究中心Kai Schulze教授馈赠。禽呼肠孤病毒S1133 株，购自中国兽医药品监察所；兔抗鸡IgG，荧光素标记的羊抗鸡IgG购自成都精博生物技术有限公 司：真核表达载体pVAxl，ARV 节炎阳性血清，均为本实验室保存；禽呼肠孤病毒油乳剂灭活苗购于InteventIntematlo皿at．B．v公司。 肋mⅣI、Ⅳi以Ⅲ、1∞NA连接酶购 pMD一19Tsimple、氨苄青霉素(Amp)、卡那霉素(Kall)， Plus DNA聚合酶，DNA胶回收试剂盒，DNA 于大连宅生物工程有限公司；Taq Marker购于天根生物 科技有限公司。 1．1．2主要仪器 高速冷冻离心机3K18型，Sigma圆，德国产；超纯水处理器，Milli—Qplus，法国产；梯度PCR 仪，P)【2，伯e啪o 碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司；删一2数显恒温水浴锅，金坛市富华电器有限公司；电子天 BP310 平，SanoriusS；凝胶电泳图像分析系统2000型、凝胶垂直电泳仪、半干转印仪、核酸蛋白 仪、低压液相层析仪，均为Bio．鼬～D@产品，意大利产。 1．1．3试验动物 1日龄肉鸡购自成都正大公司。 3基金项目：教育部长江学者和创新团队发展计划项目(mT0848)资助 1238 第十三次学术研讨会会议论文集 1．2方法 1．2．1 ARV oC蛋白基因的扩增 1．2．1．1引物的设计和合成 133 根据ARV毒株S1oC蛋白基因序列，设计合成引物如下： 上游引物：57一CGC△：丛适ⅡTTCAlTGTGAlboCGGGTC一3’，带有所删III酶切位点 下游引物：57一CCC垡塑正g：GAATAACCAAl℃CCAGl’ACG．37，带有肋mHI酶切位点 1．2