“基因敲除”专题探析.docVIP

“基因敲除”专题探析 　　1 基因敲除概述 　　基因敲除自20世纪80年代末发展起来，是建立在基因同源重组技术基础以及胚胎干细胞技术基础上的一种定点修饰基因组的新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术，其与体细胞核移植技术的成功结合，已经成为一种有效的定点修饰、改造大动物基因组DNA片段的实验策略。或者说基因敲除就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰、改造染色体上某一基因的目的的一种技术。它克服了随机整合的盲目性和偶然性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法。20世纪80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养试验的成功奠定了基因敲除的技术基础。1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。1987年，Thompson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型。此后的几年中，基因敲除技术得到了进一步的发展和完善。 　　简单的说，基因敲除是指将目标基因从基因组中删除。比如，有一段“序列”：“1234567890”（原基因），敲除后?椤?1237890”，一般一个敲除载体还会在其中插入一段外源基因，如“ABC”，则新的基因为“123ABC7890”，或者不插入基因直接连接，则为“1237890”。 　　通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和RNAi，它们同样可以达到基因敲除的目的。在基因敲除技术中涉及到的变异类型有基因重组、基因突变、人工诱变。 　　2 相关试题评析 　　2.1 考查基因敲除的基本原理 　　【例1】 基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，将同源DNA片段导入受体细胞，使同源DNA片段在原有位置替代了靶基因片段，达到基因敲除的目的。由此可推测（ ） 　　A. 基因敲除实际上是删除某个基因，达到使该基因“沉默”的目的 　　B. 利用基因敲除技术不能修复细胞中的病变基因 　　C. 基因敲除可定向改变生物体的某一基因 　　D. 基因敲除技术可治疗先天性愚型 　　评析：由题意可知基因敲除实际上是替换了某个基因片段，从而达到使该基因“沉默”的目的，A选项错误。基因敲除既可以是敲除相应的正常基因，也可以敲除相应的突变基因，可定向改变生物体的某一基因，B选项错误，选项C正确。先天性愚型是染色体异常引起的遗传病，多了一条染色体，不能用基因敲除治疗，D选项错误。 　　参考答案：C。 　　【例2】 基因敲除是根据DNA重组原理发展起来的一门新兴技术。通常用设计好的DNA片段替代动物细胞内的基因片段，从而达到基因敲除的目的。运用基因敲除技术构建基因敲除动物模型是研究基因功能中较为普遍的一种方法，其基本原理如图1所示。 　　请回答下列问题： 　　（1） 在将目的基因导入受体细胞前，需要构建一个基因表达载体。一个理想的基因表达载体，通常由启动子、终止子、目的基因和 等四部分组成。在此过程中，所需使用的相关工具酶是 。 　　（2） 如果要获得一只含目的基因的小鼠，则选择的受体细胞通常为 ，基因导入该细胞时，可以采用 等方法。 　　（3） 上述途径所获得的动物，其后代并非每一个个体都含目的基因，原因是 。 　　（4） 假设通过基因敲除构建了一个非球形红细胞性贫血（Ⅱ型）模型动物，该动物因丙酮酸激酶缺陷或葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）缺陷，使红细胞膜变化引起红细胞自溶现象，但若向该动物注射ATP后，自溶现象可明显降低。由此可表明，基因对生物性状的控制方式之一是： 。 　　（5） 某实验小组向正常小鼠胚胎细胞内导入某“X基因”后，发现靶基因能正常转录形成mRNA，但细胞内却不再合成相应蛋白质，其原因最可能是 　　。 　　评析：通过图示，可分析出基因敲除的基本原理：应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。 　　（1） 基因表达载体由启动子、终止子、目的基因和标记基因四部分组成，在构建基因表达载体过程中，需使用到限制性核酸内切酶和DNA连接酶。 　　（2） 培育转基因动物时，选择的受体细胞通常为受精卵，通过采用显微注射法将基因表达载体导入受精卵中。 　　（3） 转基因动物是杂合子，在产生后代时等位基因分离，所以后代并非每一个个体都含有目的基因。 　　（4） 该动物由于酶异常导致红细胞自溶，说明基因通过控制酶的合成来控制代谢过程，进而控制生物性状。 　　（5） 靶基因能正常转录形成mRNA，但不能合成蛋白质。很显然是翻译过程不能进行，究其原因是“X基因”转录形成的mRNA与靶基因转录形成