血清miR-1233对肾细胞癌诊断意义.ppt

肾癌病理类型： 　1．透明细胞癌(clear cell renal carcinoma) 为最常见的类型，占肾细胞癌的70%~80%。 　　2．乳头状癌(papillary carcinoma) 占肾细胞癌的10%~15%。包括嗜碱性细胞和嗜酸性细胞两个类型。　 　　3．嫌色细胞癌(chromophobe renal carcinoma) 在肾细胞癌中约占5%。　　肾癌的类型还包括集合管癌（collecting duct carcinoma）和肾癌未分类（renal cell carcinoma, unclassified）。 肾癌无论体积大小，约80%的患者早期可无任何症状，只是在普查和因其他原因作体格检查或B超检查时才被发现其肾脏有占位病变或触摸到腹部包块。有些患者肾脏原发癌灶很小，无泌尿系或肾内症状，却首先表现出远处转移癌的症状。如发现患者腋下、腹部肿块，为找原发病灶才发现为肾癌。所以及时的了解肾癌症状是非常重要的。 但是目前还未发现用于诊断肾癌的血清标志物。 已有研究发现在癌细胞中微小RNA表达水平发 生了改变，因此微小RNA有可能作为癌症患者的诊断或预后的标志物，我们的研究旨在分析肾细胞癌患者循环血清中微小RNA的水平变化。 Low Density Arrays： Quantitative Real-Time PCR： SYBR-Green 染色 SYBR-Green灵敏度比EB高25~100倍 SYBR-GreenⅠ：荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中SYBR-GreenⅠ的不会发射任何荧光信号 SYBR-GreenⅡ：广泛用于检测琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶中的RNA或单链DNA。 2、聚丙烯酰胺凝胶电泳分类 1） 根据凝胶系统的均匀性，可分为连续性和不连续性聚丙烯酰胺凝胶电泳。 连续性：整个电泳系统中所用的凝胶网孔、缓冲液及pH都是相同的，电泳时沿电泳方向的电势梯度均匀分布，简单易行； 不连续性：系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、pH和凝胶孔径，电泳过程中形成的电势梯度不均匀，能将较稀的样品浓缩成密集的区带，从而提高分辨率。 2）根据凝胶溶液和电泳缓冲液对样品构象的影响，可分为变性电泳和非变性电泳两类。 非变性：用于双链DNA片段的分离和纯化、有功能蛋白的分离与纯化。 3）根据在样品缓冲系统中是否加入还原剂β-巯基乙醇或二硫苏糖醇，可将聚丙烯酰胺凝胶电泳分为还原电泳和非还原电泳。在前者中蛋白质的二硫键将被破坏，而在后者中则可以保留。如果蛋白质的二聚体或寡聚体是由链间二硫键来维系的，那么用该系统还可以区分目的蛋白的亚基聚合形式。 4）根据凝胶形状的不同还可以将聚丙烯酰胺凝胶电泳分为圆盘电泳和平板电泳。前者指在圆形玻璃管内制胶，电泳后形成的区带为圆盘状；而后者是指凝胶的形状为平板状，有水平和垂直两种。平板电泳可同时进行多个样品的比较，而且还可作双相电泳，分辨率更高。 聚合影响因素 大气氧能淬灭自由基，阻止多聚体链长的增加。在进行化学聚合前，一般用减压抽气的办法除去溶液中溶解的空气。在胶液表面，往往覆盖一层水或溶液，隔绝空气，可加速聚合。 低温、低pH都会减慢聚合反应速度。 有些材料如聚丙烯酸甲酯有机玻璃，一些金属等可抑制聚合反应。 凝胶的物理性质如筛孔大小、机械强度、弹性、透明度都取决于凝胶总浓度（T）和Acr与Bis两者之比。凝胶总浓度（T）和交联度（C）的计算公式分别为： Acr/Bis： 20~40 完全透明且有弹性； ＜10 很脆，易碎，不透明； ＞100 糊状不成形，易破碎。 标准胶：在总浓度为7.5% 的凝胶中，大多数生物体内的蛋白质能得到满意的分离效果。 对于一个未知样品，常用7.5%的标准胶或4%-10% 的凝胶梯度来测试，而后选出适宜的凝胶浓度。 6、分离效应 其分离效应包括： 浓缩效应(不连续系统中) 电荷效应 分子筛效应 不连续垂直柱状聚丙烯酰胺凝胶电泳的浓缩效应 系统的不连续性表现在以下方面： 1）凝胶由上、下两层凝胶组成 上层为大孔径的浓缩胶 下层为小孔径的分离胶 2）缓冲液离子组成、各层凝胶的pH不同 电极缓冲液为pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液 浓缩胶为pH6.7的Tris-HCl缓冲液 分离胶为pH8.9的Tris-HCl缓冲液。 3）在电场中形成不连续的电位梯度 （1）凝胶孔径不连续性： 在电场作用下，颗粒在大孔胶中泳动遇到的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，颗粒泳动受到的阻力大，移动速度减慢。因而在两层凝胶交界处，由于凝胶孔径的不连续性使样品迁移受阻而压缩