分子杂交 生命科学前沿 教学课件.pptVIP

DNA Example First strand GGGTTTAAACCC Second strand CCCAAATTTGGG Nucleic acids have a net negative charge and will move from the left to the right. The larger molecules are held up while the smaller ones move faster. This results in a separation by size. （三）探针标记技术 1 标记物：放射性和非放射性两种 放射性： 非放射性：生物素、荧光素 2、标记方法 （1）随机引物法 （2）末端标记法 （3）单链DNA探针标记 （4）寡核苷酸探针标记法 原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。 用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。 3.DNA fingerprinting (指纹) forensics (法医学) Fingerprint Molecular biology technology has rapidly revolutionized the field of forensics. Forensics is the scientific analysis of evidence from crime scenes (犯罪现场). It is possible to determine whether or not the suspected is crimes or innocent from trace sample, e.g., a drop of blood, a hair……. * 分子杂交技术 这种方法已成为遗传学和分子生物学等生命学科中 最为普遍和重要的方法之一。 分子杂交（molecular hybridization）是用一个DNA单链或RNA单链与另一被测DNA单链形成双链，以测定某特异序列是否存在。 （一）Southern Blot 该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern 首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 将待检测的DNA分子用/不用限制性内切酶消化后，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其它标记物标记的DNA或RNA探针进行反应。 如果待检物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补的原理进行结合，游离探针洗涤后用自显影或其它合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。 原理： 一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到 一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上， 即印迹（blotting）; 二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度 和离子强度下退火，即分子杂交过程。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程： Southern Blot 操作步骤： 1, DNA 2, 琼脂糖电泳 3, NaOH变性 4, 印迹转移 5, 预杂交 6, 杂交（变性探针） 7, 洗膜 8, 显影或显色 * DNA 大于10kb时， Hcl加水分解 2, 琼脂糖电泳 3，变性 1.5 M NaOH处理30min 溴酚蓝(BPB) 3，印迹转移 凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。 A, 毛细管转移法 （0.4M NaOH） B, 电转移法 为使核甘酸固定在膜上， 传统的方法是将膜置于真空烘箱中80℃烘2小时。 在紫外交联仪上仅需在254nm紫外光下照射几秒钟即可。 用无关的单链DNA，如小牛胸腺DNA和鲑鱼精子DNA吸附到 膜上的空白处，称预杂交，防止探针被吸附在背景上。 4，预杂交 65C 10min Base pairing indicatesthe gene of interest 5, 杂交（变性探针） 双链DNA探针提前100℃变性10min后迅速冰浴，单链探针无需变性。将处理后的探针加入杂交液温浴至杂交温度。 应用寡核苷酸探针时，杂交温度的选择。 Tm＝4╳(G+C)+2╳(A+T), 杂交温度比Tm低约10℃。 杂交 探针 32P、35S 和 3H 将基因组DNA经限制性内切酶酶切，进行琼脂糖电泳，把分离后定位在凝胶上的不