遗传性痉挛性截瘫家系致病基因定位和基因突变的临床特点及遗传方式分析.docVIP

精品论文 参考文献 遗传性痉挛性截瘫家系致病基因定位和基因突变的临床特点及遗传方式分析 柯新1 梁永玲1 刘奇迹2 　　(1山东省威海市经济技术开发区医院骨科 264205;2山东大学医学院遗传研究所 250012） 　　【摘要】目的 通过对山东省威海地区一个遗传性截瘫家系进行了定位和基因突变的临床特点及遗传方式分析，确定该病的遗传类型及其发生机制。方法 经家系调查及临床检查确定疾病类型；通过致病基因微卫星多态位点进行连锁分析。结果 该家系的遗传性痉挛性截瘫常染色体显性遗传发现该家系中患者在SPAST基因第15外显子存在一个14bp的缺失突变。结论 遗传性痉挛性截瘫家系致病的突变为位于SPG4基因第15外显子的一个14bp的缺失突变所致。 　　【关键词】SPG4基因 连锁分析 突变分析 临床特点 遗传方式 　　【中图分类号】R74 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085（2014）20-0141-02 　　家族遗传性截瘫是一种神经系统退行性变性疾病，是遗传性共济失调中较多见的类型。我们在山东省威海市发现了一个大家系，所有患者呈典型的单纯性遗传性痉挛性截瘫症状。我们采用候选基因分析方法对该家系进行了基因定位和基因突变分析。 　　一、研究对象 　　山东省威海地区发现了一个遗传性截瘫大家系，健在的家系成员现有四代，核心成员23人，其中患者4人。 　　二、研究方法 　　1.家系的临床调查：(1) 家系调查：我们对家系中所有能追溯到的成员进行直接的临床检查，并绘制家系的系谱图。(2) 临床及体格检查：由当地医院相关科室临床医生对家系中的成员进行病史采集和体格检查，并记录检查结果。(3) 辅助检查。 　　2.家系成员的标本采集。根据知情同意原则，抽取家系中各成员的外周静脉血3～5ml，加入0.2mlACD抗凝，充分混匀；提取各成员的基因组DNA。 　　3.微卫星DNA多态位点的选择与引物合成。单纯型常染色体显性遗传性痉挛截瘫的最常见致病基因位点为SPAST，该基因在染色体上的位置为2p21-p24。 　　4.候选基因SPAST基因的突变检测： 　　4.1 设计候选基因的引物。根据GeneBank数据库中提供的候选基因SPAST的基因组序列，利用Primer Premier 5.0软件设计。 　　4.2 PCR产物测序及测序结果分析。分别用上、下游引物对PCR扩增产物进行测序。 　　4.3家系成员的突变检测。以家系中其余成员（Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅱ8、Ⅲ1、Ⅲ4、Ⅲ6、Ⅲ10、Ⅲ11、Ⅲ12、Ⅳ1）的DNA为模板进行SPAST基因第15外显子的PCR扩增(373bp)、产物测序及结果分析。方法同上。 　　三、结果 　　1.家系调查与基本情况。该家系（图1）共有四代，我们采集到11名家系成员（Ⅱ3、Ⅱ5、Ⅱ8、Ⅱ10、Ⅲ1、Ⅲ4、Ⅲ6、Ⅲ10、Ⅲ11、Ⅲ12、Ⅳ1）及1名配偶（Ⅱ11）的血样，其中含有4名患者（Ⅱ3、Ⅱ8、Ⅱ10、Ⅲ1）的血样。将所采集的家系成员的外周静脉血提取基因组DNA，检测DNA纯度和浓度后放于﹣20℃冰箱保存。 　　图1. 山东地区发现的一个遗传性痉挛性截瘫家系 　　2.家系的临床特征。家系中Ⅱ3、Ⅱ10具有遗传性痉挛性截瘫的典型症状；Ⅱ8则表现较轻微；Ⅲ1刚到发病年龄，已经表现出明显的症状。家系中还有2名携带者（Ⅲ6和IV1），尚无症状。 　　3.家系的遗传特点。该家系中男女均有患病，女性患者多于男性。 　　4.基因型分析和计算LOD Score值如图2： 　　图2 两STR位点与SPASTIN基因在染色体上的位置及SPASTIN的基因结构示意图 　　5.1 我们用扩增SPAST基因全部开放性阅读框架序列以及外显子内含子剪切序列的引物对家系中先证者Ⅱ10的DNA模板进行PCR扩增及正反向测序，并将测序结果与GenBank中SPAST（NM_000166）的基因序列进行比对，发现该家系中患者在SPAST基因第15外显子存在一个14bp的缺失突变（c.1630-1643delTACTCAGGAAGTGA）。 　　5.2 我们又以该家系成员的DNA为模板，扩增SPAST基因第15外显子及外显子内含子剪切序列并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段大小及亮度，随后利用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法分离突变条带并用银染法显示DNA条带。与sanger测序结果一致，我们运用同样的方法未检测到该位点的突变，可以排除该突变为多态位点。 　　6.人类基因突变数据库查询突变。经查询人类基因突变数据库（HGMD），证实SPAST基因第15外显子的(p.tyr544profsX28)突变为一新突变，国内外尚未见相关报道