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第二章 核酸的基本操作技术 本章的主要内容 核酸的提取 核酸的检测与保存 核酸的凝胶电泳 核酸的分子杂交 第一节 核酸的提取 一、 DNA的提取 DNA是生物的主要遗传物质，因而DNA的制备是基因工程的基础。由于生物形式的多样性（细菌、植物、动物），以及DNA在生物体中存在形式的差异（染色体、线性DNA、质粒），因此，制备DNA的过程和方法也不相同。 （一）DNA在生物体中的存在形式 1、染色体DNA 是生物体遗传信息的主要载体 * 原核生物染色体：结构简单，储存的信息相对较少 * 真核生物染色体：结构复杂，储存大量的遗传信息 用途：分离目的基因，研究基因的调控与表达 （二）DNA提取的一般步骤 准备生物材料： 选用的材料应处于提取DNA得率最高的生长期。如：提取大肠杆菌质粒DNA，菌液应培养至对数生长后期(测定OD600值）；提取植物DNA，最好选取幼嫩的部分。 （三）细菌总DNA的制备（E.coli） 1.菌体培养: 将活化的菌体接种于LB(Luria- Bertani) 培养基，于37 oC培养至对数生长期,然后置冰水浴20min 2.收集菌体: 离心(5000 g， 5 min) (50 ml) 3.菌体裂解: 加5ml冷 TES(0.1 M Tris-HCl,0.1 M EDTA， 0.15 M NaCl，pH 8.0)加10 mg 溶菌酶，于37 oC 温育10 min 4.去RNA: 加入1 mg RNaseA，于室温温育15 min 5.去蛋白: 加入0.6 ml 10% SDS和Protease K(0.1mg/ml)， 50 oC，3h，加苯酚-氯仿抽提(等体积) 6.沉淀DNA: 加入1/10 V 的NaAc，2 V 无水乙醇以玻璃 棒缠绕絮状沉淀，溶于TE Buffer中 有时还需要加入CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）除去细菌多糖。 基本原理：CTAB可溶解细胞膜，与核酸形成复合物，在高盐溶液中是可溶的；在低盐溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白质、多糖类物质分开；然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液，再加入乙醇使核酸沉淀，而CTAB溶于乙醇。 特点：能较好的去除糖类杂质，对于含糖较高的材料最为合适;在提取前期能同时得到高质量的DNA及RNA 2 、所用的试剂作用 ⑤ NaAc-HAc缓冲液 3、碱抽提法提取质粒DNA的步骤 第二步：破膜，蛋白质和DNA变性 4、 影响质粒DNA产量的因素 （2）质粒拷贝数 若干常用质粒的理论产量 （五）动物细胞DNA的提取 提纯的思路： 动物DNA的特性：分子量较大，易断，提取过程中应尽量避免剧烈的搅拌，并注意抑制组织中DNase的活性。 要去除的杂质：RNA、蛋白、多糖、脂类及各种小分子杂质。 （六）植物基因组DNA的提取 提纯的思路 a、植物DNA的特性：分子量较大，易断，提取过程中应尽量避免剧烈的搅拌，并注意抑制组织中DNase的活性，同样要去除蛋白、多糖、脂类、 小分子物质等杂质。 b、植物细胞具有细胞壁，不易破碎，并为了保持其DNA完整性，可采用去污剂温和处理法破碎细胞，对于破碎较困难的材料，还可辅加蛋白酶K，在酶的存在下共同破碎细胞。 提取思路 mRNA的提取 mRNA的提取对于进一步研究基因的结构及其表达调控是必要的。mRNA占RNA总量的5％左右，主要存在于细胞质中，且大部分与蛋白质结合在一起形成核蛋白体。 真核mRNA的提取通常有两条途径： a.先提取总的RNA，再从中分离mRNA； b.先提取多聚核糖体，再将蛋白质与mRNA分开。 利用寡聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸纤维素柱层析，把mRNA与其它的RNA分开。因为几乎所有的mRNA3’端都具有polyA的序列，而tRNA和rRNA上都没有这样的结构。进行oligo(dT)-纤维素柱层析时，只有3’端有polyA的mRNA才与oligo(dT)结合，从而达到与其它RNA分离的目的。 要成功的提取mRNA，也应尽可能完全抑制或去除RNA酶的活性。 寡聚(dT)-纤维素柱法提纯mRNA的过程 柱平衡（以上柱缓冲液洗脱纤维素柱，至柱流出液 的pH值小于8.0) 装柱( RNA水溶液于65℃温育5min，迅速冷却后按 RNA水溶液︰ 上柱缓冲液=