慢性粒细胞白血病端粒酶活性检测的临床意义.docVIP

精品论文 参考文献 慢性粒细胞白血病端粒酶活性检测的临床意义 山东省寿光市人民医院 262700 摘要：目的：探讨端粒酶活性检测对慢性粒细胞白血病（CML）的临床意义。方法：选取20例慢性期和10例急性转化期（加速期或急变期）的CML病例，以良性血液病病人和正常人作对照，采用改良TRAP-银染法及亚利恩凝胶成像系统分析检测其骨髓标本内的端粒酶活性水平并随访。结果：良性血液病端粒酶阴性或低水平表达；CML慢性期端粒酶活性中等增高（F=36.38，q=5.84，P lt;0.01），阳性率达35%（7/20）；急性转化期时端粒酶活性较慢性期显著升高（q=12.06，P lt;0.01），阳性率达80%（8/10）。端粒酶活性水平与CML预后相关，活性高者往往预后较差。结论：端粒酶活性与CML的发生发展密切相关。端粒酶活性检测可以作为CML诊断、病程监测及预后判断的一个有用的生物学指标。 关键词：白血病??髓样；慢性；端粒酶；诊断；预后 1 资料与方法 1.1 对象及分组 30例CML病人中，初诊的慢性期病人20例，男10例，女10例，年龄23～64岁，平均（43.6plusmn; 12.1）岁；急性转化期（加速期或急变期）病人10例，男7例，女3例，年龄15～63岁，平均（35.2plusmn;16.2）岁。所有CML病人均经染色体分析证实为Ph阳 性CML。另取25例良性血液病病人及15例正常人为对照。良性血液病包括缺铁性贫血（IDA）14例，巨幼细胞贫血（MA）6例，特发性血小板减少性紫癜（ITP）5例。对照组年龄为18～60岁，平均（30.2plusmn; 13.1）岁。所有病人诊断均符合文献［1］标准，正常对照均经骨髓细胞形态学检查排除血液病。 1.2 材料 1.2.1引物 端粒酶底物引物（TS）：5prime;-AATC-CGTCGAGCAGAGTT-3prime;；下游CX引物：5prime;-CCCTTACCCTTACCCTTACCCTAA-3prime;（上海生物工程公司合成）。 1.2.2主要试剂 Taq聚合酶和牛血清清蛋白购自Promega公司。HEPES、CHAPS、DTT、EGTA、AEBSF购自Sangon公司。 1.2.3主要仪器 2400型PCR扩增仪系美国PE公司产品；凝胶成像分析仪购自YALIEN公司。 1.3 实验方法 1.3.1分离计数MNC 取骨髓液标本常规分离MNC。 1.3.2端粒酶提取 参考文献［2］的方法，取细胞悬液加适量裂解缓冲液［含有10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.5），1 mmol/L MgCl 2，1 mmol/L EGTA，0.1 mmol/L PMSF，5 mmol/L beta;-巯基乙醇、体积分数0.005的CHAPS及体积分数0.10的甘油］调整细胞数为107 /L，置-20 ℃保存。 1.3.3TRAP反应 参考文献［2］方法略加改进，50 mu;L反应体系［20 mmol/L tris-HCl（pH 8.3），1.0 mmol/L MgCl 2，63 mmol/L KCl，0.05 g/L Tween 20，1 mmol/L EGTA，50 mu;mol/L dNTPs，0.1 mu;g TS引物，0.1 g/L牛血清清蛋白，2 mu;L端粒酶提取液，0.1 mu;g CX引物，2U Taq DNA聚合酶］30 ℃孵育30 min后，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环，72 ℃保温3 min。 1.3.4电泳及银染 PCR扩增产物经120 g/L聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将凝胶置固定液（体积分数0.10的无水乙醇、体积分数0.005的乙酸新鲜配制）中固定，经AgNO3 染色10 min，置显色液（30 g/ L的NaOH、4 g/L的甲醛新鲜配制）中显色保存。 1.3.5端粒酶活性测定 端粒酶阳性结果在凝胶上可见每隔6个核苷酸的梯形条带。用凝胶成像分析软件处理，得出各标本的相对吸光度（A）值代表端粒酶活性。并根据 A 值大小将端粒酶活性分为阴性、弱阳性、阳性、强阳性4个等级。同时据 A 值大小将慢性期CML分为高活性组（ge;2.0）和低活性组（lt;2.0）。 2 结果 2.1 正常对照组端粒酶活性 经凝胶成像分析系统分析，15例正常对照者骨髓端粒酶活性为0.74plusmn;0.57，无1例阳性或强阳性，均呈阴性或较低水平表达。 2.2 良性血液病对照组端粒