第四章 基因工程常规技术2 聚合酶链式反应(tk).ppt

Chapter Four基因工程的基本技术 一、什么是PCR ? 是体外核酸扩增技术。1985年美国PE-Cetus公司的K.B. Mullis 等发明的。 DNA是由四种碱基按互补配对原则组成的螺旋双链。在细胞内， DNA复制时，解螺旋酶首先解开双链让它变成单链做为模板，然后，RNA聚合酶合成一小段引物（primer）结合到DNA模板上，最后， DNA合成酶以这段引物为起点，合成与DNA模板配对的新链 PCR就是在体外模拟DNA复制的过程，它用加热的办法让DNA片段变性变成两条单链，让人工合成两个引物结合到DNA模板两端， DNA聚合酶即可以大量复制该模板。 它具有特异、敏感、产率高、 快速、 简便、重复性好、易自动化等突出优点 （一）原理 （三）PCR基本反应 以DNA为模板的反应 反应体积：50~100μL buffer 引物一对 底物：4种dNTP 模板：102~105拷贝 耐热DNA聚合酶（ TaqDNA聚合酶） 矿物油 模板DNA的用量可根据其分子量的大小调整 PCR缓冲液 在PCR体系中Buffer通常采用10mmol/LTris-HCl （pH8.3-9.0），其中的二价阳离子（通常为Mg2+）可以激活DNA聚合酶的活性中心， Mg2+的浓度可影响PCR扩增产物的特异性。 K+（50mmol/L）利于引物与模板的退火 明胶或血清白蛋白及去污剂（Tween20）起到对TaqDNA聚合酶的稳定作用 循环参数 变性温度和时间：按模板DNA复杂程度来调整变性温度和时间。94 ℃ ，1min；95 ℃ ，30 s ；97 ℃ ，15 s ； 退火温度和时间：45~55 ℃ ，30 s~1 min 延伸温度和时间：72 ℃ ，时间因扩增片段的长度而异：1kb，1min；3~4kb,3~4min 循环次数：25~35次，视最初靶分子浓度而定 （一）PCR引物设计 PCR效率和特异性取决于两个方面：一是引物与模板的特异结合，二是聚合酶对引物的有效延伸。 PCR引物设计原则 1.引物长度一般15~30个核苷酸。引物过短会使PCR的特异性降低，过长会提高相应的退火温度，并使延伸温度超过TaqDNA聚合酶的最适温度74℃,亦会影响产物的生成，且合成引物成本增加 2.引物中的碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤、嘧啶的堆积现象。尤其是引物的3′端不应有连续3个G和C。否则会使 引物在模板的G+C富集序列区错误配对。引物中G+C的含量 在45~55%左右。设计引物时要考虑3′端和5′端 引物具有相似的Tm值。Tm=4（G+C）+2（A+T）。引物长度要确保解链温度不低于54℃ 3.引物自身内部不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。一般引物自身存在的连续互补序列，不超过3bp 4.两引物之间不应存在互补序列，尤其是3′端 5.引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性。尤其是引物3′末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 6.引物3′端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3′端的最佳碱基选择是G和C。因为它们形成的碱基配对比较稳定。 7.引物的5′端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素，荧光物质，地高辛标记，加入其它短序列包括起始密码子等。在PCR的起始反应中，引物5′端游离的碱基并不影响引导新生链DNA合成的能力。但在后续的扩增循环中，这些与初始模板不配对的序列被带到PCR产物的双链中去，所以如此引物参与的PCR产物，既含有目的扩增片段又含有两侧引入的核苷酸序列 （二）模板的取材 病原体标本：病毒、细菌、真菌、螺旋体、立克次体、支原体等 病理生理标本：细胞、血液、绒毛、尿液等 法医学标本：血斑、精斑、毛发 考古标本 （三）TaqDNA聚合酶 Taq DNA聚合酶在75~80℃具有最高的聚合酶活性。75~80℃每个酶分子每秒可延伸约150个核苷酸， 70℃时 60个核苷酸/秒以上。 55℃时 22个核苷酸/秒； 37℃ 1.5个核苷酸/秒 22℃时 0.25个核苷酸/秒。 温度超过80℃时，合成速度明显下降，可能与引物和模板结合稳定性遭到破坏有关， 72 ℃最适温度。 Taq DNA聚合酶没有3′→5′外切酶活性。没有校正功能。对于30次循环的PCR扩增反应。此酶的错配率为0.1%～0.25%。 Taq DNA聚合酶具有类似未端转移酶的功能，能催化dNTP加到DNA的3′-OH端。但对4种dNTP聚合到3′-未端的能力不同，对dATP的聚合能力高于其他3种核苷酸，因此PCR产物的末端总是带有两个A 附：Pfu DNA聚合酶 此酶来自激烈热球菌（Pyrococc