第六章 载体.pptVIP

包装有限制，λ φDNA全长48kb，必需基因为28kb,包装外源基因限制全长105-75％（即51－28＝23kb;36 －28 ＝ 8kb）包装限制范围为12-23kb。 The end 质粒的类型和特性 传递类型： ①接合型：含有自主转移基因，使质粒从一个细胞转移到另一个细胞。如： F质粒、部分R、Col质粒 ②非接合型：不含有自主转移基因，质粒不能自主从一个细胞转移到另一个细胞。如：部分R、Col质粒（安全常用） 复制类型： ①严紧型：低拷贝 1-3个拷贝/菌 ②松弛型：高拷贝 10-60个拷贝/菌 特性：自主复制、转移、选择标记遗传特性、不相容性（同者相斥、异着共存）、分配功能（亲代 子代） 特性： CopA和CopB基因 1.复制： 负调控 RI质粒：repA基因表达 复制 PSC101 ：正调控 是由ori复制子向左单向复制 2.不相容性；在同一细胞中，同类质粒不能并存的现象。PUC18 PUC19 分配功能：质粒复制后，随细胞分裂的进行，质粒分配到子细胞中。 Triton和PEG化学提取法 Triton和PEG处理法，此法简单，不用昂贵的氯化铯，不必长时间的超速离心，费用较低，分离效果也很好，此法大体过程如下： 培养菌体并加入氯霉素使质粒扩增→离心沉淀菌体。在TE缓冲液中悬浮→加入溶菌酶和去污剂Triton部分裂解菌体→35000r/min离心除去菌体，留上清液→上清液用酚处理除去蛋白质→用乙醇初步沉淀DNA→将DNA悬浮于TE缓冲液中→加聚乙二醇（PEG6000），在4℃下过夜→10000r/min离心15分钟→DNA沉淀悬浮后再用乙醇沉淀→将DNA沉淀悬浮即得到提纯的质粒DNA。 煮沸裂解菌体，异丙醇沉淀质粒DNA 该法简便迅速，是实验室中制备小量质粒DNA时常用的一种方法。将菌液移入1.5ml塑料管，离心去上清，先用Triton和新鲜配制的溶菌酶处理细胞，100℃加热60秒种裂解细菌细胞。将裂解液放置冰浴2分钟，离心5分钟，根据不同的复性特性，从而去除染色体DNA及细胞碎片。然后用酚氯仿抽提上清去除蛋白质，再加入异丙醇，置于室温20-30分钟，离心取沉淀，70%乙醇洗两次，最后悬浮于TE，即为提纯的质粒DNA。根据实验要求，亦可省去酚：氯仿抽提步骤，使实验在2小时内完成。 多功能质粒-PUC质粒 多功能质粒-PUC质粒是由pBR322改建成的带有LacZ基因的PUC质粒。 LacZ 上有多克隆位点，插入外源基因后在X-gal平板上使原先的蓝斑变成白斑。 插入型载体 在λimm434区有EcoRI单一酶切位点便于外源DNA插入的称为插入型载体。 λ gt10（CI) λgt11(LacZ) 若 CI插入外源基因 溶菌 透明噬斑 若 不插入外源基因 溶源 混浊斑 若LacZ插入基因 IPTG/X-gal平板有白斑 若LacZ无插入基因 IPTG/X-gal平板有蓝斑 替换型载体 在λ NM781/791/762替换型载体的SupE基因中可校正宿主菌lacZ琥珀突变，在该基因中具有成对的EcoRI限制酶位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被插入的外源DNA片段所取代，亦称取代型载体。由于上述λ噬菌体的感染，寄主细胞lacZ基因的琥珀突变被抑制,所以能在乳糖麦康基氏(McConkey)琼脂培养基上产生红色的噬菌斑,或是在X-gal琼脂培养基上产生蓝色的噬菌斑。但如果supE基因的EcoRI区段被外源DNA所取代，那么形成的重组体噬菌体只能产生出白色的噬菌斑。可方便地筛选出阳性克隆。如图3-15 单链DNA噬菌体载体 M13单链DNA噬菌体为细线状 DNA，呈单链环状 包装在线状蛋白外壳中。载体有多聚接头，可进行LacZ插入失活白斑筛选。可应用于克隆基因，测序，基因突变的诱变技术。 三、动物细胞基因克隆的载体 ㈠SV40病毒 ㈡SV40病毒载体 (1)取代型重组病毒载体 ①晚期区段取代载体 ②早期区段取代载体 (2)重组的病毒-质粒载体 SV40病毒 SV40病毒呈小型20面体，环状DNA，外壳蛋白由VP1、VP2、VP3构成。 受纳细胞（permissive cell）：能使细胞裂解释放感染性病毒颗粒，产生CPE。 非受纳细胞（non permissive cell）：不产生感染性病毒颗粒，但能整合到细胞染色体中产生癌变。 基因结构。如图3-25 早期表达区编码大T抗原和小t抗原（即肿瘤蛋白质或抗原）。T抗原的功能是控制