发酵液中HA含量分析方法的研究.docxVIP

文章编号:1000-565X(2001)11-0055-04发酵液中HA含量分析方法的研究3周荣清郭祀远李琳胡松青(华南理工大学食品与生物工程学院,广东广州510640)摘要:比较了咔唑法、地衣酚法、阿利新蓝法和Bitter-Muir法等4种分光光度法应用于分析透明质酸质量浓度的准确度和精确度,发现Bitter-Muir法适用于测定透明质酸质量浓度;同时探讨了糖分、蛋白质、酵母膏、无机盐等发酵液组成对Bitter-Muir法分析透明质酸质量浓度的影响.结果表明,这些组成对该分析方法有一定程度的干扰.关键词:透明质酸;发酵液;分析方法中图分类号:O657.3文献标识码:A透明质酸(HyaluronicAcid,简称HA)是一类带负电荷的大分子粘多糖,广泛地存在于各种生物体的结缔组织中.自1934年Meyer和Palmer[1]首先从牛眼的玻璃体中分离出HA以后,由于它具有比较特殊的物理化学性质[2,3],目前被已广泛地应用于临床治疗与诊断和化妆品中[4～7].在20世纪80年代以前,HA的主要来源是动物的软组织(如鲸的软组织、眼睛的玻璃体和鸡冠等器脏)及脐带,这不仅仅原料资源有限、HA的含量低,也比较难以实现大规模的生产,而且在生产过程中HA的分子易被降解变小.1983年日本资生堂成功地开发的HA微生物生产技术[8]已引起了众多科学研究者的广泛关注.无论何种来源,HA的结构和组成都是一样的,都是按r(D-葡萄糖醛酸)∶r(乙酰氨基-D-葡萄糖)=1∶1的比例组成的.目前,用于分析HA含量的方法有咔唑法[9]、地衣酚法[9]、阿利新蓝法[10]和咔唑法经改良后的Bitter-Muir法(又称改良咔唑法)[11]等分光光度法.这些方法都是基于HA中葡萄糖醛酸与显色剂反应生成显色物质,并且能在一定的浓度范围内遵循朗伯-比尔定律.本文作者在比较上述几种方法分析透明质酸质量浓度的准确度和精确度的基础上,比较系统地探讨了糖分、蛋白质、酵母膏和无机盐等发酵液的主要组成对Bitter-Muir法分析HA质量浓度所产生的影响.1材料与方法主要试剂和仪器设备(1)试剂.咔唑(上海生化试剂厂);葡萄糖醛酸1.1(美国Sigma公司);葡萄糖醛内脂(美国Acros.or2ganics公司);地衣酚(美国Fisher公司);阿利新蓝(上海化学试剂公司).(2)仪器设备.721型分光光度计(上海第三分析仪器厂);CS501超级恒温槽(重庆实验仪器厂);PHS-25型酸度计(上海伟业仪器厂).实验方法1.21.2.1HA分析方法实验为了比较各种分析方法的优劣,我们先作出各分析方法的标准曲线.以葡萄糖醛酸为标准制作10,20,30,40℃下咔唑法的标准曲线;以葡萄糖醛酸为标准制作地衣酚法标准曲线;以HA为标准制作阿利新蓝法标准曲线;以葡萄糖醛内脂为标准制作Bitter-Muir法标准曲线.在20℃的温度下,用咔唑法测定实际质量浓度收稿日期:2001-03-213基金项目:四川省科委重大攻关项目基金资助(970072)作者简介:周荣清(1960-),男,博士,高级工程师,主要从事发酵工程相关领域的研究.分别为200,100,66.67,50μg/mL的HA溶液数次;用地衣酚法测定实际质量浓度分别为180,90,60,45μg/mL的HA溶液数次;用Bitter-Miur法测华南理工大学学报(自然科学版)56第29卷定实际质量浓度分别为180,90,60,45μg/mL的HA溶液数次,然后再计算各种方法的测量值、相对误差和标准偏差.1.2.2发酵液各种组成对Bitter-Muir法的影响分别配制不同质量浓度的葡萄糖、蛋白质、酵母膏或NaCl溶液作为溶剂空白,配制不同质量浓度的葡萄糖、蛋白质、酵母膏或NaCl存在下不同实际质量浓度的HA溶液作为样品溶液.采用Bitter-Muir法测定HA溶液的质量浓度.图3Fig.3阿利新蓝法标准曲线Alcianstandardcurve2结果与讨论标准曲线:ρ=52.91μg·mL-1(A530),R2=0.99482.1HA分析方法的比较2.1.1各种分析方法的标准曲线采用咔唑法、地衣酚法、阿利新蓝法、Bitter-Muir法分别测定HA的标准曲线,如图1～4所示.图4Bitter-Muir法标准曲线Fig.4Bitter-Muirstandardcurve标准曲线:ρ=227.27μg·mL-1(A530),R2=0.99092.1.2各种分析方法的比较从图1及相应的回归方程可知,在不同的操作温度条件下,葡萄糖醛酸质量浓度与吸光度值之间的线性关系是不同的,因此,在操作过程中必须严格控制温度,否则该法难以准确地反映出样品中的HA含量.从表1可以看出,在操作温度一定时,咔唑法测定HA的质量浓度可以获得较好的准确度和精确度,但是,